基于RPA-CRISPR-荧光法的虎源性成分核酸快速检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物，特别涉及一种基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、crispr-cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crisprs）是细菌中一种适应性免疫系统，cas蛋白通过rna引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，crispr-crispr属于cas酶第二家族，用来引导rna指导双链dna裂解单个ruvc催化结构域。crispr酶识别富含胸腺嘧啶（thymine, t）核苷酸的间隔区相邻基序（pam），催化它们自身的指导crispr rna（crrna）成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链dna(dsdna)。当crispr-crispr蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链dna时，能诱导强大的非特异性单链dna（ssdna）反式切割活性。通过crispr-cas切割活性，结合荧光pcr报告系统，可以特异性获得靶基因荧光信号。且灵敏度高，满足不同检测环境的室温检测需求。

2、虎是世界上体形最大的猫科动物，现存5个虎亚种包括东北虎 （panthera tigrisaltaica）、苏门达腊虎（panthera tigris sumatrae）、华南虎（panthera tigrisamoyensis）、印支虎 （panthera tigris corbetti）和孟加拉虎（panthera tigristigris）。目前中国境内野生虎的数量已十分稀少。为了野生动物贸易能够持续发展各国制定了相应的野生动物保护法规禁止濒危动物的捕杀和贸易。国际上于1975年签署了 《濒危野生动植物种国际贸易公约 （cites）》中国于1981年加入该公约。尽管公约的成员国已达160个野生动物非法狩猎和野生动物走私活动在世界各地仍非常猖獗。继续威胁着野生动物的生存。一些对虎豹皮和器官或制品有传统需求的民族随着经济水平的提高有足够的财力来获得挚爱的皮革、器官及其制品这种需求极大地刺激了猫科动物的非法贸易而国际间监管、执法的难度让保护力量显得过于苍白。在野生动物取证过程中有些情况下其产品经加工处理后失去了可辨认的形态特征为此虎制品的鉴定工作十分困难。为了更有效地加强虎类的保护工作建立一种可以对虎dna进行特异性检测且准确性高、实用性强的方法从分子水平上对可疑来自于虎的样品 （例如食品、药品、皮毛等 ）进行特异性检测鉴定是十分急需和必要的。

3、目前，对于虎类物种及其源性制品的鉴定技术主要依赖于传统形态学鉴定技术、蛋白质电泳法、实时荧光定量检测技术和基于扩增子测序和dna条形码检测技术。形态学鉴定技术依赖于专业人士的长期研究积累，可以快速对物种进行区分，但是其鉴定严重依赖于完整的特征性形态，而对于相关制品，特别是加工过的样本，例如虎骨酒类、肉类、血液等不具备形态学特征的样本则无法完成鉴定。蛋白质相关分析方法对于经过加热的导致蛋白变性的样本也无法完成检测鉴定。而基于dna的分子生物学方法则体现出了明显的检测优势。但荧光定量pcr技术和基于扩增子测序和dna条形码检测技术均严重依赖高级别分子生物学实验室和较为大型的仪器设备，且检测成本较高，检测周期也比较长，无法满足现场快速检测的实际场景需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对虎源性成分物种特异性现场快速检测鉴定的难题，提供一种灵敏度高、特异性强、快速检测化的用于虎源性成分特异性快速核酸检测的crispr荧光检测试剂盒及其检测方法。用于对虎源性成分特异性靶序列进行检测。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括适用于虎源性成分核酸快速检测的crispr荧光检测体系，所述crispr荧光检测体系包括：针对虎源性成分线粒体cytb基因上靶序列的特异性crrna、高效等温扩增引物组合、crispr蛋白和ssdna报告系统。

4、所述特异性crrna为从12条针对虎源性成分线粒体cytb基因设计的crrna中筛选所得，为t-cr1的序列如seq id no：2所示。

5、所述高效等温扩增引物组合为经筛选后选择的针对序列如seq idno：1所示的虎源性成分线粒体cytb基因14957-15097位置的扩增引物p1-虎428与p2-虎568，扩增引物p1-虎428与p2-虎568的序列分别如seq id no：13和seq id no：17所示。

6、所述ssdna报告系统包含可用荧光定量pcr仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的ssdna fq reporter，序列如seq id no：18所示。

7、基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测方法，其特征在于，采用所述的基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

8、步骤a：取样器取100μl待测血、肉、骨样品；

9、步骤b：利用dna提取试剂盒提取制品的核酸；

10、步骤c：利用高效等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得的核酸，和序列如seq idno：13和seq id no：17所示的高效等温扩增引物组合加入到rpa等温扩增体系中进行rpa等温扩增，37 ℃下反应10 min，获得特异性产物；

11、步骤d：利用crispr荧光检测体系识别切割虎源性成分特异性核酸片段：将步骤b获得的特异性产物加入crispr荧光检测体系，于37 ℃反应10min；

12、步骤e：利用荧光pcr仪检测判读待检测样品中是否存在虎源性成分特异性核酸。

13、一种针对虎源性成分线粒体cytb基因上靶序列的特异性crrna在基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测中的应用。

14、本发明首先，对样品进行核酸提取和富集，并在等温条件下同时进行重组酶聚合酶扩增（rpa）和crispr-crrna复合物结合并切割靶标dsdna，其激活ssdna的反式切割，与ssdna偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为dna核酸内切酶靶向crispr反式报告基因的新方法，为快速准确检测虎源性成分特异性核酸提供了强有力的平台。

15、综上本发明的有益效果是：

16、1、首次采用rpa-crispr-荧光定量pcr法特异性检测虎源性成分，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势，其检测结果可在荧光灯下进行肉眼直接判读。

17、2、公开了一套用于虎源性成分特异性核酸检测的crispr反应体系和特异性crrna，方便用于现场动物源性成分快速检测鉴定。

技术特征：

1.基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括适用于虎源性成分核酸快速检测的crispr荧光检测体系，所述crispr荧光检测体系包括：针对虎源性成分线粒体cytb基因上靶序列的特异性crrna、高效等温扩增引物组合、crispr蛋白和ssdna报告系统。

2.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述特异性crrna的序列如seq id no：6所示。

3.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述高效等温扩增引物组合的序列分别如seq id no：13和seq id no：17所示。

4.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述ssdna报告系统包含用荧光定量pcr仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的ssdna fq reporter，序列如seq id no：18所示。

5.基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测方法，其特征在于，采用如权利要求1-4任一所述的基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测试剂盒进行检测。

6.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.一种针对虎源性成分线粒体cytb基因上靶序列的特异性crrna在基于rpa-crispr-荧光法的虎源性成分核酸快速检测中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于RPA‑CRISPR‑荧光法的虎源性成分核酸快速检测方法及试剂盒。本发明首次应用RPA‑CRISPR‑荧光定量PCR法进行物种检测，采用虎物种及其源性成分特异性检测引物，在常温体系中进行虎物种线粒体基因扩增，产生特异性扩增曲线，解决虎物种检测特异性不高、检出限循环数较低、近源物种易混淆、重复操作等问题。特异性引物、crRNA设计合理，特异性好，检测灵敏度高。

技术研发人员：万超,贾贇,杨爱馥,杨春光
受保护的技术使用者：大连海关技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19