单引物至双引物扩增子转换的制作方法

本公开涉及用于在扩增反应期间转换扩增子末端的方法。具体而言，其涉及将单引物pcr扩增子转化为双引物pcr扩增子。

背景技术：

1、扩增反应，诸如聚合酶链式反应(pcr)，广泛用于许多应用中。例如，可以扩增dna或rna用于制备文库用于dna测序(例如，下一代测序)。全基因组扩增(wga)或全转录组扩增(wta)包括单引物pcr，其可以与需要双引物产生的扩增子的应用直接不相容。这通常通过将衔接子直接连接至wga或wta扩增子或在切除wga/wta引物序列后完成。需要一种在pcr期间转换引物的快速且有效的手段。

2、用于制备文库用于下一代测序的一般工作流程包括模板片段化、末端修复、衔接子连接和pcr扩增。成功扩增的关键是将衔接子连接至dna片段的两个末端。连接通常是非定量的，因此当对难以察觉低量的核酸进行测序时，该工作流程变得困难。这些方法通常需要两个或更多个纯化步骤用于移除衔接子(在扩增前)，可能影响扩增后的文库代表。

3、引入衔接子序列的另一种通常高产的选项是通过引物延伸。对于wga/wta，这涉及延伸有尾的简并或聚-a引物，在一些rna种类的情况下，其与模板杂交。当使用简并末端的5’侧不同正向和反向尾部时，引物二聚体扩增通常是最普遍的产物。当使用简并碱基的5’侧的单一共同引发序列时，引物二聚体被有效地最小化。这是由于形成非常低效扩增的短稳定引物二聚体发夹。较长的扩增子也形成发夹，但比小引物-引物“棒棒糖”引物二聚体结构(相对于茎的小得多的环)稳定性小得多，允许更有效的扩增。

4、对于核酸文库，知道文库扩增子相对于其模板的“方向性”或方向经常是重要的。经设计以定向扩增低量rna的一种基于引物延伸的wta方法涉及使用“模板转换”，而不是与本文所述的“引物转换”概念混淆。另一种定向rna扩增方法采用连接(和多个纯化步骤)。该方法依赖于第二链cdna合成期间的dutp掺入，随后连接测序衔接子和尿嘧啶dna糖基化酶消化第二链，随后进一步对所得反义cdna文库进行双引物pcr扩增。

5、因此，需要适用于低输入量和/或低质量(ffpe)、缺乏纯化步骤并且能够指示扩增产物链型(strandedness)的核酸扩增方法。

技术实现思路

1、在本公开的各个方面中，提供了将单引物pcr扩增子转化为双引物pcr扩增子的方法。所述方法包括用能够消化单引物pcr扩增子的5'部分的酶处理单引物pcr扩增子以形成消化的扩增子，和用一对与消化的扩增子的未消化部分具有同源性的引物扩增消化的扩增子，由此形成双引物pcr扩增子。

2、本公开的其他方面和迭代包括从dna或rna扩增。rna具有定向和非定向扩增的选项。方法也可以应用于多重扩增，其中减少第一引物末端的3’简并性以包括预定组的靶扩增子而不是完全或部分简并的混合物。在所有情况下，通过使用单一pcr引物用于初始扩增来抑制引物二聚体扩增。

3、dna的扩增需要使用靶向模板的引物合成复制文库，所述靶向模板的引物5'用单一pcr引物序列加尾，随后进行pcr。使靶向模板的引物退火，使用链置换dna聚合酶延伸，然后使用单一pcr引物进行pcr扩增。类似地进行非定向rna扩增。使靶向模板的引物退火，使用链置换逆转录酶/dna聚合酶延伸，然后使用单一pcr引物进行pcr扩增(参见图4和5)。定向rna扩增通过在非链置换条件下依次的第一链合成、然后第二链合成来完成。使用经工程改造至第一和/或第二链靶向模板的引物中的定向标签来监测方向性(参见图21、22和23)。可以通过工程改造至合成引物中的标签类似地监测分子身份。

4、将单引物转化为双引物扩增子需要双引物与单引物扩增子的杂交。当双引物与一些、但不是全部单一引物同源时，分子间和分子内扩增子杂合体的稳定性有效地与双引物杂交竞争(参见图6)。通过将可消化的或外切核酸酶抗性的残基工程改造至单一扩增引物和任选靶向模板的引物的序列中来减轻这种影响。消化降低了分子间和分子内扩增子杂合体的稳定性，允许通过双引物有效引发。可消化的残基包括本领域众所周知的糖基化酶敏感性和核酸酶抗性部分。优选的实施方案将尿嘧啶残基与尿嘧啶dna糖基化酶配对以使链间/链内杂交不稳定(参见图4和5)。

5、可以一般性地概述工作流程：引物延伸杂交第一引物，然后是第二(如果适用)引物，用单引物扩增，消化5’扩增子末端，然后用双引物扩增。双引物扩增子适合于下游应用，诸如但不限于下一代测序。第一和第二引物通常是多种引物，其范围为3’随机引物至定向引物对的合并物，导致产生数个至数百万个独特的扩增子(参见图14、15和16)。

6、本公开的一个进一步方面提供了多种人工寡核苷酸，其包含(a)多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸包含(5'至3')5'序列，其包含：任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列；与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列；任选的内部标签序列，其包含用于定向或和/或分子id扩增，标签序列，和3'序列，其包含随机、半随机或合并的靶标特异性序列(参见图3a)。对于定向扩增，多种第二寡核苷酸，其中每种寡核苷酸包含(5'至3')包含任选地至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列；与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列，任选的包含第二标签序列的内部标签序列，和包含随机、半随机或合并的靶标特异性序列的3'序列，条件是对于定向扩增，多种第一和第二寡核苷酸中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列。无论是从dna还是rna开始并且是定向的还是非定向的，一个进一步方面是包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的人工寡核苷酸(参见图3b)。

7、本公开的又另一个方面涵盖用于扩增dna或rna的试剂盒。所述试剂盒包含(a)任选多种合成引物，其中每种合成引物包含任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列，与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列，任选的内部标签序列，以及随机或半随机3'序列；和任选地(b)多种第二合成引物，其中每种第二合成引物包含任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列，与衔接子序列具有互补性的嵌套序列，任选的包含第二标签序列的内部标签序列，以及随机或半随机3'序列。对于定向扩增，多种第一和第二合成引物中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列。另外，试剂盒包含至少一种扩增引物，其包含合成引物的5'序列和至少一个可消化或核酸酶抗性残基。在优选的实施方案中，可消化的残基是尿嘧啶。

8、下面详述本公开的其他方面和特征。

技术特征：

1.人工寡核苷酸，其5'至3'包含：

2.人工寡核苷酸，其5'至3'包含：

3.权利要求1或2的人工寡核苷酸，其中所述5'序列具有约5至约30个核苷酸的长度，所述嵌套序列具有约5至约25个核苷酸的长度，所述任选的内部标签序列具有约4至约20个核苷酸的长度，并且所述3'序列具有约5个核苷酸至约30个核苷酸的长度。

4.权利要求1的人工寡核苷酸，其中所述可消化残基是糖基化酶敏感的碱基。

5.权利要求4的人工寡核苷酸，其中所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(fapyg)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(fapya)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。

6.权利要求1的人工寡核苷酸，其中所述5'序列包含脱氧尿苷核苷酸。

7.权利要求2的人工寡核苷酸，其中所述5'序列包含核酸酶抗性核苷酸，包括3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2'o-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。

8.权利要求2的人工寡核苷酸，其中所述5'序列具有约5至约30个核苷酸的长度，所述任选的嵌套序列具有约5至约25个核苷酸的长度。

9.多种人工寡核苷酸，其包含多种寡核苷酸，其中各自包含(5'至3')任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列；与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列，任选的内部标签序列，和包含与靶核酸同源的序列的3'序列。

10.权利要求9的多种人工寡核苷酸，其中多种合成引物的5'序列包含糖苷酶敏感或核酸酶抗性残基。

11.权利要求9的多种人工寡核苷酸，其中3'末端靶向两个或更多个模板序列。

12.用于扩增dna或rna的试剂盒，所述试剂盒包含：

13.权利要求12的试剂盒，其进一步包含逆转录酶、链置换dna聚合酶、单链特异性脱氧核糖核酸酶、热稳定dna聚合酶、尿苷dna糖基化酶和/或5'-3'外切核酸酶。

14.用于定向扩增rna的试剂盒，所述试剂盒包含：

15.用于定向扩增rna的试剂盒，所述试剂盒包含：

16.权利要求15的试剂盒，其进一步包含逆转录酶、非链置换dna聚合酶、3'-5'脱氧核糖核酸酶、热稳定dna聚合酶、尿苷dna糖基化酶或5'-3'外切核酸酶和/或放线菌素d。

技术总结
本发明涉及单引物至双引物扩增子转换。提供了用于在扩增反应期间引物转换的方法。具体而言，提供了用于将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法。

技术研发人员：B.沃德,C.克里德尔,K.霍伊尔曼,J.K.罗伯特
受保护的技术使用者：西格马－奥尔德里奇有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8