一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法。

背景技术：

1、fmoc-ala-ala-asn-pab/h-ala-ala-asn-pab是一种蛋白可降解(cleavable)的多肽前体药物连接子，是抗体偶联药物(adc)的常用连接桥，在人体血浆中有一定的稳定性。fmoc-ala-ala-asn-pab/h-ala-ala-asn-pab，结构式分别如下：

2、

3、中国专利cn 106456799 a公开了一种fmoc-ala-ala-asn(trt)-pab的液相合成方法，该专利先分别合成二肽fmoc-ala-ala-oh和h-asn(trt)-pab，偶联两个二肽得到fmoc-ala-ala-asn(trt)-pab，总收率67.7％。中国专利cn 113274507a公开了一种h-ala-ala-asn-pab的液相合成方法，同专利cn 106456799a一样，该专利先合成得到二肽h-asn(trt)-pab，偶联二肽boc-ala-ala-oh得到boc-ala-ala-asn(trt)-pab，过柱纯化后，酸切保护剂得到h-ala-ala-asn-pab，总收率11.37％。

4、液相合成连接子fmoc-ala-ala-asn-pab/h-ala-ala-asn-pab，合成路线及合成周期长，综合收率低，成本高，难以实现产业化生产。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法。本发明采用固相合成的方法结合特殊的合成策略，从asn开始，先合成ala-ala-asp片段，最后偶联pab，最终有效地提高了连接子的总收率和纯度，总收率均能达到90％以上，hplc纯度达到97％以上，解决现有技术中存在的上述不足之处。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法，包括如下步骤：

4、(1)在氨基树脂上逐一偶联asp、ala和ala的保护氨基酸，获得第一肽树脂；所述asp的n端和主链c端分别偶联有保护基，所述两个ala的n端偶联有保护基。

5、(2)脱除所述第一肽树脂上asp羧基端的保护基，偶联pab，获得第二肽树脂；

6、(3)将所述第二肽树脂裂解，获得fmoc-ala-ala-asn-pab或h-ala-ala-asn-pab。

7、本发明在第二肽树脂裂解的过程中，asp转化成asn。

8、本发明中，所述asp的主链羧基偶联有保护基，所述保护基为oall或obzl，优选oall。

9、一些实施方案中，所述asp的保护氨基酸为fmoc-asp-oall；所述ala的保护氨基酸为fmoc-ala-oh。

10、一些实施方案中，所述氨基树脂包括苄胺linker型树脂；所述苄胺linker型树脂为rink amide-am resin、mbha resin或sieber resin；所述rink amide-am resin的取代度为0.5-1.0mmol/g，优选0.6-0.8mmol/g，具体可为0.6mmol/g、0.7mmol/g、0.8mmol/g。

11、本发明中，所述偶联的反应介质为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜中的一种或多种，优选n,n-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

12、本发明中，所述偶联和脱保护的温度为25-45℃，优选30-40℃，具体可为30℃、35℃、40℃。

13、本发明中，步骤(1)和步骤(2)中所述偶联采用的缩合试剂为a、b、c、d中任意一种或几种，其中，a选自dic、dcc、edci中的任意一种，b选自hoobt、hobt、boat中的任意一种，c选自dipea、nmm中的任意一种，d选自dmap、hbtu、hatu、tbtu、pybop、eedq中的任意一种。

14、本发明中，所述保护基的脱保护剂为哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液，优选地，所述哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液的浓度为20％～50％，具体可为20％、30％、40％、50％，其中优选20％。步骤(2)中oall的脱保护剂为含pd(pph3)4和ph-sih3的二氯甲烷溶液；优选地，所述肽树脂、pd(pph3)4和ph-sih3的摩尔比为1:(0.1～1):(1～10)，具体可为1:0.5:1：1:0.5:10、1:0.5:5、1:0.1:5、1:1:5，更优选为1:0.5:5。

15、本发明中，步骤(3)中所述裂解用的裂解液为三氟乙醇的二氯甲烷溶液，三氟乙醇的二氯甲烷溶液的浓度优选为30％～80％，具体可为30％、40％、50％、60％、70％或80％，更优选为50％。

16、一些具体实施例中，本发明所述包括如下步骤：

17、a)以苄胺linker型树脂为固相合成载体，偶联保护氨基酸fmoc-asp-pg，得到起始肽树脂：fmoc-asp(-rink amide-am resin)-oall；

18、b)采用fmoc-固相合成法，依次偶联fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh，获得第一肽树脂：fmoc-ala-ala-asp(-rink amide-am resin)-oall；

19、c)脱除所述fmoc-ala-ala-asp(-rink amide-am resin)-pg上asp羧基端的保护基pg，加入h-pab-oh偶联，获得第二肽树脂：fmoc-ala-ala-asp(-rink amide-am resin)-pab；

20、d)将所述第二肽树脂裂解，获得fmoc-ala-ala-asn-pab或h-ala-ala-asn-pab。

21、本发明的有益效果是：本发明公开了一种抗体偶联药物连接子(fmoc-ala-ala-asn-pab/h-ala-ala-asn-pab)固相合成方法，本发明的合成过程条件温和，产品的收率高，纯度好，产物fmoc-ala-ala-asn-pab/h-ala-ala-asn-pab的总收率均能达到90％以上，hplc纯度达到97％以上，满足医药产品的纯度要求，且适于工业化大生产，本发明在裂解过程中，一种技术手段实现了两种技术效果，asp也转化为asn，取得了意料不到的技术效果。

技术特征：

1.一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，所述asp的主链羧基偶联有保护基，所述保护基为oall或obzl。

3.根据权利要求1或2所述的固相合成方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述固相合成方法，其特征在于，所述氨基树脂包括苄胺linker型树脂；所述苄胺linker型树脂为rinkamide-am resin、mbha resin或sieberresin；所述rinkamide-am resin的取代度为0.5-1.0mmol/g。

5.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，所述偶联的反应介质为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，所述偶联和脱保护的温度为25-45℃。

7.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，所述保护基的脱保护剂为哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液或含pd(pph3)4和ph-sih3的二氯甲烷溶液。

8.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述偶联采用的缩合试剂为a、b、c、d中任意一种或几种，其中，a选自dic、dcc、edci中的任意一种，b选自hoobt、hobt、boat中的任意一种，c选自dipea、nmm中的任意一种，d选自dmap、hbtu、hatu、tbtu、pybop、eedq中的任意一种。

9.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)中所述裂解用的裂解液为三氟乙醇的二氯甲烷溶液，三氟乙醇的二氯甲烷溶液的浓度为30％～80％。

10.一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法，其特征在于，包括：

技术总结
本发明公开了一种抗体偶联药物连接子的固相合成方法，包括如下步骤：包括：(1)在氨基树脂上逐一偶联Asp、Ala和Ala的保护氨基酸，获得第一肽树脂；所述Asp的N端和主链C端分别偶联有保护基；(2)脱除所述第一肽树脂上Asp羧基端的保护基，偶联Pab，获得第二肽树脂；3)将所述第二肽树脂裂解，获得Fmoc‑Ala‑Ala‑Asn‑Pab或H‑Ala‑Ala‑Asn‑Pab。本发明的合成过程条件温和，产品的收率高，纯度好，产物Fmoc‑Ala‑Ala‑Asn‑Pab/H‑Ala‑Ala‑Asn‑Pab的总收率达到90％以上，HPLC纯度达到97％以上，满足医药产品的纯度要求，且适于工业化大生产。

技术研发人员：徐峰,魏席,鄢永亮,林克威,张飞宇
受保护的技术使用者：瑞博（杭州）医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12