一种糜蛋白酶的制备方法和应用与流程

本发明涉及生物制药，具体涉及一种糜蛋白酶的制备方法和应用。

背景技术：

1、糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，在胰脏中以糜蛋白酶原的形态生物合成，随着胰液分泌出去。在小肠中，糜蛋白酶原受到胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用，转变成具有活性的α-糜蛋白酶，是丝氨酸肽链内切酶。糜蛋白酶的主要作用于芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)等氨基酸形成的肽键。

2、糜蛋白酶的应用主要集中在医疗方面：糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促进伤口愈合。在国内外，糜蛋白酶在眼科、皮肤科做临床局部应用已被肯定，国内临床上主要用于眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿，近年来，随着临床药理学研究的不断发展，其临床应用范围也日渐广泛。

3、目前，糜蛋白酶提取中主要存在的问题是产品质量低(达不到药典要求、酶活性低)、生产周期长、得率低等问题。

4、中国专利cn104531650a公开了一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的药物组合物，该方法通过以下工艺步骤：(1)多重结晶；(2)活化；(3)盐析；(4)超滤；(5)热原处理；(6)透析；(7)亲和层析；(8)冻干，制备糜蛋白酶。但是该方法存在工艺复杂，酶活性损失严重的问题。

5、中国专利cn104419695b公开了一种糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，包括下列步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与l-缬氨酸以及对氨基苯磺酸反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化糜蛋白酶原，将含有糜蛋白酶原的样品流过该亲和层析柱，糜蛋白酶原吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，将结合的糜蛋白酶原洗脱下来。(3)用胰蛋白酶进行糜蛋白酶原的激活。这种人工合成的小分子化合物配基大多价格昂贵，介质使用量大，纯化柱重复利用率低，寿命短，不适合应用于大规模生产。

技术实现思路

1、基于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种糜蛋白酶的制备方法和应用，利用超声波萃取并结合超滤、柱层析等工艺，同时使用聚乙烯磺酸钠聚合，聚醚酰亚胺降解精提糜蛋白酶，其中糜蛋白酶的提取率达70％～75％，其中制备的糜蛋白酶活性高达1659u/mg。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、第一方面，本申请提供一种糜蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1：原料预处理，使用等渗生理盐水洗涤胰脏后绞碎；

5、步骤2：浸提，向绞碎的胰脏中加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，搅拌匀浆，得到糜蛋白酶的浸提液；

6、步骤3：萃取，将浸提液萃取后冷冻离心，所得沉淀沉淀用浸提液反复溶解萃取离心，收集所有上清液；

7、步骤4：活化，向收集的上清液中添加氯化钙和胰酶粉，使用碳酸氢钠调节ph值，充分搅拌后得到活化酶液；

8、步骤5：超滤，使用超滤管超滤，将透析液浓缩，得到糜蛋白酶粗酶液；

9、步骤6：精提，向糜蛋白酶粗酶液中加入聚乙烯磺酸钠，搅拌后离心，收集不溶聚合物；向不溶聚合物中加入醋酸缓冲溶液，搅拌均匀后加入聚醚酰亚胺溶液，充分解离，冷冻离心，过滤，并收集沉淀；

10、步骤7：纯化，向沉淀中加入醋酸缓冲溶液，使用层析柱上样吸附，之后进行洗脱，收集含有糜蛋白酶活性峰的洗脱液；

11、步骤8：干燥粉碎，将收集的洗脱液冷冻，真空干燥，粉碎过筛后即得到糜蛋白酶。

12、本发明的糜蛋白酶的制备方法中，通过在精提过程中加入阴离子聚合物-聚乙烯磺酸钠，利用聚乙烯磺酸钠具有的磺酸基带负电荷的基团能够与糜蛋白酶的带正电的组氨酸残基之间发生相互静电作用而形成聚合沉淀物，同时低浓度的聚乙烯亚胺的存在可以破坏两者之间的库仑力作用，使两者相互解离，即通过加入的聚乙烯磺酸钠和聚乙烯亚胺之间的协同作用，使得制备的糜蛋白酶质量更高。

13、本发明通过疏水层析柱纯化，增加了对蛋白质的吸附能力，显著提高了蛋白质的分离效果，具有分离条件温和、不损伤蛋白质活性、分离效果高、以及柱容量大的优点。

14、本发明的整体制备方法，利用低浓度的聚电解质聚合蛋白，联用层析柱纯化的方法，达到了精简工艺、低成本生产高质量糜蛋白酶的效果，满足国内外市场需求。

15、进一步的，步骤2中加入的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为2.8mmol/l～4.2mmol/l。

16、进一步的，步骤3中的萃取温度控制在4℃～5℃。

17、进一步的，步骤4中添加的氯化钙的用量为1％～1.5％，添加的胰酶粉的用量为3‰～5‰。

18、进一步的，步骤4中加入碳酸氢钠调节ph至7.0～8.0，维持温度在20℃～30℃下充分搅拌。

19、进一步的，步骤6中加入的聚乙烯磺酸钠的浓度为0.015mol/l～0.02mol/l。

20、进一步的，步骤6中加入的醋酸缓冲溶液的浓度为0.01mol/l。

21、进一步的，步骤6中加入的聚醚酰亚胺溶液的浓度为4.0e-06mol/l～4.5e-06mol/l。

22、进一步的，步骤7中使用内装苯基-琼脂糖胶层析柱。

23、第二方面，本申请提供一种药物组合物，包括使用上述的制备方法制备的糜蛋白酶作为活性成分。

24、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

25、(1)本发明的糜蛋白酶的制备方法中，通过在精提过程中加入阴离子聚合物-聚乙烯磺酸钠，利用聚乙烯磺酸钠具有的磺酸基带负电荷的基团能够与糜蛋白酶的带正电的组氨酸残基之间发生相互静电作用而形成聚合沉淀物，同时低浓度的聚乙烯亚胺的存在可以破坏两者之间的库仑力作用，使两者相互解离，即通过加入的聚乙烯磺酸钠和聚乙烯亚胺之间的协同作用，使得制备的糜蛋白酶质量更高；

26、(2)本发明通过疏水层析柱纯化，增加了对蛋白质的吸附能力，显著提高了蛋白质的分离效果，具有分离条件温和、不损伤蛋白质活性、分离效果高、以及柱容量大的优点；

27、(3)本发明的整体制备方法，利用低浓度的聚电解质聚合蛋白，联用层析柱纯化的方法，达到了精简工艺、低成本生产高质量糜蛋白酶的效果，满足国内外市场需求；

28、(4)本发明利用超声波萃取并结合超滤、柱层析等工艺，同时使用聚乙烯磺酸钠聚合，聚醚酰亚胺降解精提糜蛋白酶，其中糜蛋白酶的提取率达70％～75％，其中制备的糜蛋白酶活性高达1659u/mg。

技术特征：

1.一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤2中加入的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为2.8mmol/l～4.2mmol/l。

3.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤3中的萃取温度控制在4℃～5℃。

4.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤4中添加的氯化钙的用量为1％～1.5％，添加的胰酶粉的用量为3‰～5‰。

5.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤4中加入碳酸氢钠调节ph至7.0～8.0，维持温度在20℃～30℃下充分搅拌。

6.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤6中加入的聚乙烯磺酸钠的浓度为0.015mol/l～0.02mol/l。

7.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤6中加入的醋酸缓冲溶液的浓度为0.01mol/l。

8.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤6中加入的聚醚酰亚胺溶液的浓度为4.0e-06mol/l～4.5e-06mol/l。

9.根据权利要求1所述的一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤7中使用内装苯基-琼脂糖胶层析柱。

10.一种药物组合物，其特征在于，包括使用权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备的糜蛋白酶作为活性成分。

技术总结
本发明公开了一种糜蛋白酶的制备方法和应用，涉及生物制药技术领域，依次进行原料预处理、浸提、萃取、活化、超滤、精提、纯化、干燥粉碎，其中精提时向糜蛋白酶粗酶液中加入聚乙烯磺酸钠，搅拌后离心，收集不溶聚合物；向不溶聚合物中加入醋酸缓冲溶液，搅拌均匀后加入聚醚酰亚胺溶液，充分解离，冷冻离心，过滤，并收集沉淀；利用聚乙烯磺酸钠具有的磺酸基带负电荷的基团能够与糜蛋白酶的带正电的组氨酸残基之间发生相互静电作用而形成聚合沉淀物，同时低浓度的聚乙烯亚胺的存在可以破坏两者之间的库仑力作用，使两者相互解离，即通过加入的聚乙烯磺酸钠和聚乙烯亚胺之间的协同作用，使得制备的糜蛋白酶质量更高。

技术研发人员：周后杰,肖勇,张忠元,唐章勇,张革,吴东,蒋维涛,姚晶婷,余露,邓沁,郭婷
受保护的技术使用者：四川德博尔制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21