一种细胞外囊泡的制备方法与流程

本发明涉及细胞外囊泡制备领域，具体涉及一种细胞外囊泡的制备方法。

背景技术：

1、间充质干细胞(msc)参与机体各种组织的损伤修复过程，可用于治疗多种心血管疾病、神经系统疾病、骨关节损伤修复、肝硬化、自身免疫性疾病等。但是作为细胞整体使用，免疫排斥反应较大，且储存、运输过程中的细胞活性难以保存，极大的限制了其在临床上的应用。

2、目前研究认为，msc主要是通过旁分泌作用发挥生物学效应，分泌的物质中最重要的就是各类尺寸的细胞外囊泡，包括外泌体及凋亡小体。与干细胞相比，其产生的细胞外囊泡具有更高的稳定性和安全性，易于储存、可作为载体应用和修饰以增加其特定属性等，这些优势使得其具有更大的再生修复潜能。外泌体和凋亡小体的研究应用方向类似，都具有调节免疫、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化等重要生物学功能，在包括创伤修复、肝纤维化、糖尿病、心梗等领域具有良好的应用前景。甚至有些研究发现间充质干细胞产生的凋亡小体的治疗作用优于外泌体。近几年，对凋亡小体的研究热度在逐渐升温。因为与活细胞产生的外泌体相比，凋亡细胞能以更高的效率产生凋亡小体，且过程更容易控制。

3、作为相邻细胞之间传递功能物质的天然载体，凋亡小体在细胞间相互作用的微环境研究中受到越来越广泛的重视，它们能够将有用的物质输送到健康的受体细胞，从而调节受体细胞的功能。由于其是从细胞膜上脱落的囊泡，因此细胞膜中的分子保留在囊泡上，为融合靶向配体提供了一种方法。凭借这些优势，凋亡小体可以成为药物递送的新型候选。根据最新研究，甚至可作为一种能够突破血脑屏障的药物递送载体。综上，凋亡小体易获、稳定、高产、可塑性强、不具有免疫排斥反应、无伦理问题，有望成为再生医学中一种较为理想的治疗手段，应用前景广阔，但以上这些都是要以能大规模制备凋亡小体为前提。

4、目前，实验室常用多种抗癌药诱导细胞凋亡，例如，蒽环类、铂类化疗药物直接破坏dna双螺旋架构，使其无法复制，抗代谢类化疗药物如星形孢菌素等，通过与合成正常代谢物所必需的酶相结合，从而抑制细胞活性。但在实际应用过程中，采用抗癌药物诱导细胞凋亡得到的细胞外囊泡产率低，制备过程复杂，尤其药物价格昂贵和毒性残留等缺点，极大的限制了该方法在工业化生产和临床治疗方向的应用。

技术实现思路

1、针对以上现有技术中细胞外囊泡的产率低、成本高、有毒性、不利于工业化和未来临床应用的问题，本发明提供了一种细胞外囊泡的制备方法，不引入抗癌药物，安全无毒，成本低，容易实施，能实现细胞外囊泡的大批量制备。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种细胞凋亡诱导液，按照质量百分比计，包括：1.5％～2.4％的氯化钠，1％～4％的葡萄糖，1％～4％的乙醇，余量为水。

4、优选的，所述的细胞凋亡诱导液，按照质量百分比计，包括：2％的乙醇，1.5％的氯化钠，2％的葡萄糖，余量为水。

5、一种细胞外囊泡的制备方法，包括：

6、s1，用权利要求1或2所述的细胞凋亡诱导液处理细胞，得到含细胞外囊泡的液体；

7、s2，将含细胞外囊泡的液体离心取上清液，然后通过超滤膜进行超滤浓缩，将所得液体过滤除菌，获得细胞外囊泡。

8、优选的，s1具体包括：用权利要求1或2所述的细胞凋亡诱导液重悬细胞，所得细胞悬液摇床孵育1～3h，得到含细胞外囊泡的液体；

9、优选的，s1具体包括：用权利要求1或2所述的细胞凋亡诱导液重悬细胞，所得细胞悬液先摇床孵育1～3h，然后加入细胞悬液20～50倍体积的含葡萄糖生理盐水溶液，搅拌1～3h，得到含细胞外囊泡的液体。

10、优选的，用细胞凋亡诱导液处理细胞的过程中持续通入n2、co2和o2的混合气体，按照体积百分比计，所述混合气体包括：90％～92％的n2，5％的co2，3％～5％的o2。

11、优选的，所述细胞为间充质干细胞。

12、优选的，所述细胞外囊泡为凋亡小体。

13、采用所述的制备方法得到的细胞外囊泡。

14、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

15、本发明所述细胞凋亡诱导液包括乙醇、氯化钠和葡萄糖，其中：乙醇通过氧化应激和硝化应激等途径诱发细胞损伤导致凋亡；氯化钠和葡萄糖导致的高渗透压可以促进细胞内的水分排出，显著缩小细胞内容物的体积，有助于相同细胞膜面积形成更多体积小的凋亡小体(总膜面积相同的情况下，一个大球的容积显著大于数个小球的容积之和，即一个细胞如果要尽可能多的产生凋亡小体，其内容物的总体积需要显著缩小，才能保证细胞膜够用，这个过程中，排掉水分是最经济且容易实施的选择，因为其他成分属于功效成分，且不易透过细胞膜)，体积小的凋亡小体在体内循环时间长，不易被吞噬细胞吞噬，作为载体优势更大。实验结果表明，相对于单组份或双组分，乙醇、氯化钠和葡萄糖三因素联用，不仅诱导凋亡的效果最佳，且释放的凋亡小体的量远高于单因素诱导增量之和，说明乙醇、氯化钠和葡萄糖三者联用具有协同增效的作用，各组分结合极大的提高了凋亡诱导效率和细胞外囊泡产量。

16、本发明所述细胞外囊泡的制备方法，采用上述的细胞凋亡诱导液进行细胞凋亡诱导，然后从收集的液体中分离出细胞外囊泡(主要是凋亡小体)。该方法不引入抗癌药物，通过该方法收集的细胞外囊泡进行后续治疗应用，没有药物残留导致的安全隐患，安全无毒；且与单组分诱导的细胞凋亡相比，剂量低，时间短，效率高，可均匀且高效地诱导细胞的快速凋亡，工业化批量产生细胞外囊泡，可用于多种细胞类型生产细胞外囊泡，从而在疾病治疗和药物递送领域发挥重要作用，为凋亡小体的工业化和临床应用打好基础。本发明所述细胞外囊泡生产过程中，使用的细胞可以提前用饥饿处理(即无血清培养)，迫使细胞对环境成分(如药物)摄入增加，细胞吞入药物后，经本发明所述方法生产的细胞外囊泡中也会有药物，该细胞外囊泡可作为药物成分的载体进行后续临床应用(如加入靶向分子精确针对目标器官，减少副作用)；同时细胞吞噬的药物可以有多种组合，得到多种产物，增加后续应用方向的多样性，提升工业化价值。

17、进一步的，以细胞悬液形式进行细胞凋亡诱导处理，各细胞受胁迫的程度相同，凋亡程度更同频；与已有实验室细胞凋亡诱导方法不一样的地方在于，本发明注重了凋亡起始诱导后对于凋亡过程的维护(凋亡过程需要能量供应)，不仅凋亡诱导液中含有葡萄糖，在凋亡诱导1～3h后还有60％以上活细胞存在的情况下，继续用含葡萄糖的生理盐水孵育1～3h，保证尽可能多的细胞发生凋亡及尽可能多的收集凋亡小体。补充葡萄糖有效避免了凋亡诱导后的继发性坏死，增加了细胞外囊泡的产量；搅拌提供的剪切力有助于细胞外囊泡脱离胞体成型，增加细胞外囊泡产量。

18、进一步的，细胞凋亡诱导过程中持续通入低氧气体则是为了保证体系处于均匀的低氧环境中，减少局部高氧叠加处理条件导致的细胞坏死(接触空气的液面附近氧含量高)。

技术特征：

1.一种细胞凋亡诱导液，其特征在于，按照质量百分比计，包括：1.5％～2.4％的氯化钠，1％～4％的葡萄糖，1％～4％的乙醇，余量为水。

2.根据权利要求1所述的细胞凋亡诱导液，其特征在于，按照质量百分比计，包括：2％的乙醇，1.5％的氯化钠，2％的葡萄糖，余量为水。

3.一种细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：

4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，s1具体包括：用权利要求1或2所述的细胞凋亡诱导液重悬细胞，所得细胞悬液摇床孵育1～3h，得到含细胞外囊泡的液体。

5.根据权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，s1具体包括：用权利要求1或2所述的细胞凋亡诱导液重悬细胞，所得细胞悬液先摇床孵育1～3h，然后加入细胞悬液20～50倍体积的含葡萄糖生理盐水溶液，搅拌1～3h，得到含细胞外囊泡的液体。

6.根据权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，用细胞凋亡诱导液处理细胞的过程中持续通入n2、co2和o2的混合气体，按照体积百分比计，所述混合气体包括：90％～92％的n2，5％的co2，3％～5％的o2。

7.根据权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞为间充质干细胞。

8.根据权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡为凋亡小体。

9.采用权利要求3～8任一项所述的制备方法得到的细胞外囊泡。

技术总结
本发明提供了一种细胞外囊泡的制备方法，利用含有乙醇、氯化钠和葡萄糖的细胞凋亡诱导液处理细胞，得到含细胞外囊泡的液体；然后分离得到细胞外囊泡。本发明方法不引入抗癌药物，通过该方法收集的细胞外囊泡进行后续治疗应用，没有药物残留导致的安全隐患，安全无毒；且与单组分诱导的细胞凋亡相比，剂量低，时间短，效率高，可均匀且高效地诱导细胞的快速凋亡，工业化批量产生细胞外囊泡，可用于多种细胞类型生产细胞外囊泡，从而在疾病治疗和药物递送领域发挥重要作用，为凋亡小体的工业化和临床应用打好基础。

技术研发人员：王哲,明磊国,董玲娟,屈艳玲
受保护的技术使用者：陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17