血清迁移体ATF6作为乳腺癌脑转移分子标志物的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种血清迁移体atf6作为乳腺癌脑转移分子标志物的应用。

背景技术：

1、肿瘤脑转移发病率占9％-17％，其导致的死亡率占20％。乳腺癌仅次于肺癌是引发脑转移的第二位实体恶性肿瘤。约25％的晚期乳腺癌患者最终发展为脑转移。乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastases,bcbm)严重影响患者的认知、言语、动作协调性及生活质量。乳腺癌脑转移致死率高、预后极差，患者的中位生存期仅为6个月，1年存活率低于20％。

2、迁移体是近年由清华大学俞立教授团队发现的一种迁移依赖的新型膜性细胞器/细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)。迁移体的产生依赖于细胞的迁移运动，可作为一种新的方式向胞外释放胞质成分。细胞运动过程中，在细胞尾部会生成管状结构，称为收缩丝；随着迁移运动的发生，细胞收缩丝的尾部或交叉处生成囊泡结构，即为迁移体。研究表明：在不同生物体内具有细胞迁移运动行为的区域存在迁移体；当细胞迁移后，迁移体留在原地，直至破裂或者被其他细胞吞噬，并释放出供体细胞的成分。最新研究表明：在急性缺血性脑卒中后肺炎中，骨髓间充质干细胞分泌的迁移体内容物dcd分子可以增强肺巨噬细胞lc3相关吞噬作用保护中风后肺炎；在斑马鱼胚胎原肠运动时期产生大量的迁移体，干预迁移生成后，胚胎的发育会受到影响；在这些迁移体中富集众多信号调节因子、趋化因子等，直接参与胚胎发育的调控。因此，迁移体含有mrna和蛋白质，可以横向转移到受体细胞中，调控机体疾病的发生发展。迁移体作为ev样结构的一种类型，虽然其功能研究取得了初步发展，但在肿瘤转移中的作用尚不清楚。

3、在人体血清中发现迁移体的存在，说明迁移体可能通过血液循环长距离传递信号分子，从而调控机体各器官形态发生。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种血清迁移体atf6作为乳腺癌脑转移分子标志物的应用。解决了目前临床上缺乏乳腺癌脑转移血清迁移体的现状。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：血清迁移体atf6作为乳腺癌脑转移分子标志物的应用。

3、一种乳腺癌脑转移的迁移体标志物，所述迁移体标志物为atf6。

4、一种检测atf6的试剂盒，所述试剂盒包含有检测atf6的试剂。

5、所述试剂包含有上游引物和下游引物。

6、所述上游引物的核苷酸序列表如seq id no:1所示和下游引物的核苷酸序列表如seq id no:2所示。

7、一种数字pcr技术检测atf6的mrna表达变化的方法，其特征在于包括如下步骤：

8、(1)rna提取、处理及逆转录：从血液中提取血清迁移体，使用trizol提取迁移体总rna，依据逆转录试剂盒说明书进行逆转录；

9、(2)数字pcr扩增：

10、扩增体系8μl cdna,11μl 2×dpcr evagreen master mix,1.0μl上游引物(10μm),1.0μl下游引物(10μm),ddh2o调整总体积至22μl。

11、反应程序：液滴平铺60℃,5min,taq酶热启动95℃15min,各1个循环；95℃15s，60℃30s,40个循环；荧光信号采集60℃,60s,1个循环。

12、接下来设计合成血清迁移体atf6的pcr引物，通过数字pcr技术鉴定血清迁移体atf6在乳腺癌脑转移及其他乳腺癌及正常人群的表达水平；并且通过western blot技术进一步鉴定血清迁移体atf6的表达变化。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

14、1.迁移体是大小400nm-3000nm的细胞外囊泡，随着迁移运动的发生，细胞收缩丝的尾部或交叉处生成囊泡结构。

15、2.本发明发现一种血清迁移体atf6在乳腺癌脑转移患者中高表达，其他乳腺癌患者及正常人群中低表达。

16、3.本发明发现了一种乳腺癌脑转移相关的血清迁移体atf6检测试剂，填补了目前缺乏乳腺癌脑转移相关检测试剂。

17、4.本发明血清迁移体atf6可以作为乳腺癌脑转移分子标志物。

18、5.本发明发现慢病毒敲除脑微血管内皮细胞(hcmec/d3)的atf6，能够抑制乳腺癌脑转移，加入迁移体后，逆转这一现象。

技术特征：

1.血清迁移体atf6作为乳腺癌脑转移分子标志物的应用。

2.一种乳腺癌脑转移的迁移体标志物，其特征在于：所述迁移体标志物为atf6。

3.一种检测atf6的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有检测atf6的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂包含有上游引物和下游引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述上游引物的核苷酸序列表如seq idno:1所示和下游引物的核苷酸序列表如seq id no:2所示。

6.一种数字pcr技术检测atf6的mrna表达变化的方法，其特征在于包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述引物为权利要求5所述引物。

技术总结
本发明公开了一种血清迁移体ATF6的用途，同时也公开了检测正常人群、乳腺癌以及乳腺癌脑转移患者血清迁移体ATF6含量变化。本发明涉及迁移体的鉴定，包括鉴定血清迁移体的结构大小以及其特征殊蛋白的表达。本发明还涉及数字PCR技术检测患者血清迁移体ATF6的差异表达分析，证实迁移体ATF6在乳腺癌脑转移患者血清中高表达，在乳腺癌患者和正常人群中低表达。本发明涉及的数字PCR技术具有高灵敏度，强干扰性以及绝对定量等优点，适用于类似迁移体低核酸量的定量。血清迁移体ATF6可以作为乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物，还可作为乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点。

技术研发人员：付波,王松,咸新苗,顾国浩,郭健冉,李敏,褚苗苗,张伟
受保护的技术使用者：聊城市人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24