一种同时检测感染性腹泻致病原虫的LAMP引物组及检测试剂盒

本发明属于病原检测，具体涉及一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp引物组及检测试剂盒。

背景技术：

1、感染性腹泻在全球具有较高的发病率和死亡率，尤其是在低收入和中等收入国家，是引起儿童和免疫功能低下人群感染性腹泻发生的主要诱因。细菌、病毒、原虫等是引发感染性腹泻发生的主要诱因，目前细菌和病毒引发的感染性腹泻已经引起广泛关注，但是由原虫引发的感染性腹泻并未受到重视，原虫并不是临床腹泻样本检测的常规指标，但由原虫经过水、食品、接触等多种途径感染而引发的腹泻已经成为临床感染性腹泻的主要诱因，其中隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫和等孢球虫等经过水、食品、接触等途径传播而导致的腹泻已成为全球公共卫生的新挑战。

2、目前，基于样品中病原体洗脱-富集-染色-镜检是检测水、食品和环境样本中病原虫污染的基本方法，针对粪便样本则是以复杂染色和显微镜检查为主，而基于染色-镜检的检测方法具有一定的不确定性，因为染色后原虫形态的识别敏感性低，需要专业人员进行判断。

3、分子生物学检测方法主要有pcr、rpa、lamp等技术，优点为检测结果可靠，可以处理高通量样品，还可以进一步对隐孢子虫种进行种类鉴定、基因分型、进化树分析等；缺点是过程步骤繁琐、费时费力，客观因素导致的问题较多；免疫学检测法包括荧光标记抗体检测、酶标记抗体检测等方法基于抗原和抗体的特异性结合原理，需要提取血清或组织，但操作稍困难。此方法具有一定的特异性和灵敏度，但相较分子生物学诊断方法较低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp引物组及检测试剂盒，可实现1个样本中6种原虫的同时检测，并且特异性好，灵敏度高。

2、本发明提供了一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp引物组，所述lamp引物组分别针对隐孢子虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫和等孢球虫的18s rrna基因设计得到，针对贾第鞭毛虫的tpi基因设计得到。优选的，针对各感染性腹泻致病原虫设计的引物组如表1所示：

3、表1针对各感染性腹泻致病原虫设计的引物信息

4、

5、

6、本发明还提供了一种包含上述lamp引物组的同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp试剂盒。

7、优选的，所述lamp试剂盒包括lamp-微流控芯片检测试剂盒。

8、优选的，还包括10×thermopol reactionbuffer、dntps、bst聚合酶、mg2+、甜菜碱和双蒸水。

9、优选的，还包括至少包含6个反应孔的微流控芯片。

10、本发明还提供了一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp-微流控芯片试剂盒，包括固定有上述lamp引物组的微流控芯片；

11、还包括10×thermopol reactionbuffer、dntps、bst聚合酶、mg2+、甜菜碱和双蒸水。

12、优选的，还包括阴性对照。

13、本发明还提供了根据上述lamp试剂盒或上述lamp-微流控芯片试剂盒在构建特异性检测感染性腹泻致病原虫的高通量工具中的应用。

14、优选的，所述检测的样品包括水、食品、环境样本和临床粪便样本。

15、有益效果：本发明提供了一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp引物组，针对隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫、等孢球虫这6种典型感染性腹泻致病原虫，分别以其种属特异性核酸序列为目标片段，设计得到特异性的lamp引物组，并建立基于lamp-微流控芯片的感染性腹泻致病原虫的高通量检测方法和试剂盒，可在60min内完成隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫、等孢球虫核酸的同时检测，对隐孢子虫的最低检测限为102拷贝/μl、贾第鞭毛虫的最低检测限为101拷贝/μl、阿米巴原虫的最低检测限为100拷贝/μl、微孢子虫的最低检测限为102拷贝/μl、环孢子虫的最低检测限为102拷贝/μl、等孢球虫的最低检测限为102拷贝/μl，该芯片具有良好的特异性，6种致病原虫彼此之间无交叉反应，同时不同浓度梯度的基因组重复性良好，稳定性高。

技术特征：

1.一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组分别针对隐孢子虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫和等孢球虫的18s rrna基因设计得到，针对贾第鞭毛虫的tpi基因设计得到。

2.根据权利要求1所述lamp引物组，其特征在于，针对隐孢子虫的18srrna基因设计得到的引物组包括yf3、yb3、yfip、ybip、ylf和ylb，所述yf3的核苷酸序列如seq id no.1所示，yb3的核苷酸序列如seq id no.2所示，yfip的核苷酸序列如seq id no.3所示，ybip的核苷酸序列如seq idno.4所示，ylf的核苷酸序列如seq id no.5所示，ylb的核苷酸序列如seq id no.6所示；

3.一种包含权利要求1或2所述lamp引物组的同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp试剂盒。

4.根据权利要求3所述lamp试剂盒，其特征在于，所述lamp试剂盒包括lamp-微流控芯片检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述lamp试剂盒，其特征在于，还包括10×thermopol reactionbuffer、dntps、bst聚合酶、mg2+、甜菜碱和双蒸水。

6.根据权利要求4或5所述lamp试剂盒，其特征在于，还包括至少包含6个反应孔的微流控芯片。

7.一种同时检测感染性腹泻致病原虫的lamp-微流控芯片试剂盒，其特征在于，包括固定有权利要求1或2所述lamp引物组的微流控芯片；

8.根据权利要求3～6任一项所述lamp试剂盒或权利要求7所述lamp-微流控芯片试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照。

9.根据权利要求3～6任一项所述lamp试剂盒或权利要求7所述lamp-微流控芯片试剂盒在构建特异性检测感染性腹泻致病原虫的高通量工具中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述检测的样品包括水、食品、环境样本和临床粪便样本。

技术总结
本发明提供了一种同时检测感染性腹泻致病原虫的LAMP引物组及检测试剂盒，涉及病原检测技术领域。本发明针对隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫、微孢子虫、环孢子虫、等孢球虫这6种典型感染性腹泻致病原虫，分别以其种属特异性核酸序列为目标片段，设计得到特异性的LAMP引物组，并建立基于LAMP‑微流控芯片的感染性腹泻致病原虫的高通量检测试剂盒，可在60min内完成同时检测，该芯片具有良好的特异性，6种致病原虫彼此之间无交叉反应，同时不同浓度梯度的基因组重复性和稳定性良好。

技术研发人员：尹静,杨忠委,王华然,杨栋,师丹阳,李君文
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24