本发明涉及基因检测领域,具体涉及人类mthfr-1298基因多态性检测用标准品产品及其制备方法。
背景技术:
1、叶酸又名蝶酰谷氨酸,对细胞生长以及蛋白质、氨基酸的合成起着关键作用,在人体内发挥着重要的生物学作用,缺乏叶酸可致多种疾病,如先天性心脏病、妊娠高血压、唐氏综合征等。
2、叶酸代谢途中有多种酶参与代谢与转运,5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶,作用是催化同型半胱氨酸代谢的甲基供体5-甲基四氢叶酸合成;甲硫氨酸合成酶还原酶(mtrr)作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态,维持甲基传递通路继续进行,降低同型半胱氨酸在体内的积累。mthfr与mtrr协同工作,维持叶酸的正常代谢,控制同型半胱氨酸在体内的正常水平。mthfr基因a1298c、c677t和mtrr基因a66g位点的突变,可导致酶活性降低,引起叶酸代谢障碍,是造成叶酸代谢水平降低和同型半胱氨酸水平升高的遗传学原因。
3、基因多态性检测的主要方法有:限制性片段长度多态性(rflp)检测、生物质谱检测、测序法检测、taqman探针检测、基因芯片检测等方法。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。目前实时荧光定量pcr检测法相比普通pcr具有更高的灵敏度和特异性,被广泛应用。因此,开发一种可贯穿基于荧光定量pcr基因检测的人类mthfr-1298基因多态性检测用标准品,对实验室内检测结果的失控状况及失控原因、了解不同医疗单位之间检验结果的差距具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、针对上述不足,本发明提供了一种人类mthfr-1298基因多态性检测用标准品产品及其制备方法。本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品由永生化细胞系gm20730和细胞保存液制得。本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品定值结果良好,可适用于不同仪器型号定量检测、不同实验室操作人员检测;可用于mthfr基因多态性检测方法的方法验证和质量控制,可以更准确的检测样本检测结果的准确性。本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品在-20℃或-80℃下可稳定保存。
2、本发明的技术方案包括:
3、一方面,本发明提供了一种mthfr基因多态性检测用的标准品,其特征在于,所述标准品包括细胞系和细胞保存液;
4、所述细胞系为永生化细胞系gm20730;
5、所述细胞保存液由hepes、nahco3、d-葡萄糖和酚红组成。
6、具体地,所述hepes为2.0-2.5g/l、nahco3为1.8-2.0g/l、d-葡萄糖为0.5-1.5g/l。
7、优选地,hepes为2.38g/l、nahco3为1.91g/l、d-葡萄糖为1g/l。
8、具体地,所述细胞保存液中细胞的浓度为>1×106个/ml。
9、优选地,所述细胞保存液中细胞的浓度为>1-4×106个/ml。
10、具体地,所述酚红为ph指示剂,观察颜色的变化,因此不对酚红进行定量。
11、具体地,所述mthfr基因包括但不限于mthfr c677t或mthfr a1298c。
12、优选地,所述mthfr基因为mthfr a1298c。
13、另一方面,本发明提供了一种mthfr基因多态性检测用标准品的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
14、(1)将细胞系加入培养基中培养,收集细胞,加入细胞保存液备用;
15、(2)提取含有mthfr基因突变型的细胞系基因组dna作为模板,普通pcr扩增后,通过sanger测序对多态性位点进行验证;
16、(3)对验证成功的mthfr基因突变型的细胞系基因组进行dna定量,得到标准品。
17、具体地,步骤(1)中所述的细胞系包括但不限于可稳定传代的永生化细胞系gm20730。
18、具体地,步骤(1)中所述的培养基包括但不限于dmem、f12k或rpmi 1640培养基。
19、进一步具体地,步骤(1)中所述的培养基为rpmi 1640培养基。
20、优选地,所述的rpmi 1640培养基含有2mm谷氨酰胺和10%fbs。
21、具体地,步骤(2)和步骤(3)中所述的mthfr基因包括不限于mthfr c677t或mthfra1298c。
22、优选地,步骤(2)和步骤(3)中所述的mthfr基因为mthfr a1298c。
23、具体地,步骤(2)和步骤(3)中所述的mthfr基因突变型为mthfr基因a1298c位点基因纯合突变型。
24、又一方面,本发明提供了上述标准品或上述制备方法得到的标准品在以下至少一种中的应用:
25、(1)试剂盒的阴性或阳性对照;
26、(2)室内质量控制;
27、(3)室间质量评价;
28、(4)试剂盒性能验证。
29、具体地,所述应用通过检测mthfr基因所实现。
30、本发明的有益效果为:
31、(1)本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品定值结果良好,可适用于不同仪器型号定量检测、不同实验室操作人员检测。
32、(2)本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品可用于mthfr基因多态性检测方法的方法验证和质量控制,可以更准确的检测样本检测结果的准确性。
33、(3)本发明提供的mthfr-1298基因多态性检测用标准品在-20℃或-80℃下可稳定保存。
1.一种mthfr基因多态性检测用的标准品,其特征在于,所述标准品包括细胞系和细胞保存液;
2.根据权利要求1所述的标准品,其特征在于,所述hepes为2.38g/l、nahco3为1.91g/l、d-葡萄糖为1g/l。
3.根据权利要求1所述的标准品,其特征在于,所述细胞保存液中细胞的浓度为>1×106个/ml。
4.根据权利要求1所述的标准品,其特征在于,所述mthfr基因为mthfr a1298c。
5.一种mthfr基因多态性检测用标准品的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述的细胞系为可稳定传代的永生化细胞系gm20730。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述的培养基包括rpmi1640培养基。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)和步骤(3)中所述的mthfr基因突变型为mthfr基因a1298c位点基因纯合突变型。
9.权利要求1-4任一项中所述的标准品或权利要求5-8任一项中所述的制备方法得到的标准品在以下至少一种中的应用:
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述应用通过检测mthfr基因所实现。