一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程。具体地说是一种调控杏果实色泽的功能基因papds及其应用。

背景技术：

1、色泽是评价果实成熟度和品质的重要指标。先前的研究表明，叶绿素、类胡萝卜素、花青素和甜菜素是影响水果颜色的主要色素。杏(prunus armeniaca)是我国最重要的水果作物之一，因其独特的风味、鲜艳的颜色和丰富的营养而成为一种非常受欢迎的水果。不同品种的杏果实具有不同的颜色，这主要是由于杏中类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素的含量不同造成的。类胡萝卜素有助于杏果实颜色的加深和营养价值的提高，消费者多数偏好果实颜色更深、营养价值更高的杏。然而，在生产过程中，杏果实颜色可能不稳定，这将导致果农利润下降。

2、目前，高等植物β-胡萝卜素代谢途径已被明确定义，该代谢途径中包含许多种必需的酶，其中一种即为八氢番茄红素脱氢酶(pds)。许多植物β-胡萝卜素的合成和调控机制已被探明，这些研究结果为其他β-胡萝卜素的合成和调控机制未被探明的植物中β-胡萝卜素含量的研究提供了良好的基础。但是，杏果实色泽的差异是合成β-胡萝卜素基因控制的研究目前少见报道，八氢番茄红素脱氢酶基因在杏果实中参与合成β-胡萝卜素的表达模式和功能作用尚不清楚。所以，探明能够调控杏果实色泽的功能基因，从而将其用于杏果实色泽调控具有重大意义。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种调控果实色泽的功能基因papds及其应用，以实现对杏树果实色泽的遗传改良。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种调控杏果实色泽的功能基因papds，papds基因的序列如seq id no.1所示，papds基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、含有调控杏果实色泽的功能基因papds基因编码区序列的重组载体在调控杏果实颜色中的应用，papds基因编码区序列为seq id no.1所示的序列或seq id no.3所示的序列。

5、上述的应用，重组载体的原始载体为pmd19-t，papds基因编码区序列位于pmd19-t载体的bamhⅰ和xbaⅰ两限制性内切酶位点之间，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示的序列。将papds基因插入pmd19-t后，在后续需要对papds基因进行pcr克隆时，即可以测序正确t载体为模板，与使用杏的cdna作为模板相比，使用测序正确的t载体作为模板可减少pcr时的非特异性扩增，获得较为纯净的扩增产物。

6、上述的应用，重组载体的原始载体为pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos，papds基因编码区序列插在pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体上bsaⅰ限制性内切酶的切割位置处，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示序列。该重组载体可用于papds基因的过表达，以加深杏果实的颜色和β-胡萝卜素的含量。除了pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体外，重组载体的原始载体也可以是基因工程领域中常用的载体，如病毒和其他的植物表达载体质粒等。

7、上述的应用，重组载体的原始载体为trvⅱ-gfp，papds基因编码区序列插在trvⅱ-gfp载体的ecorⅰ和xhoⅰ两限制性内切酶位点之间，papds基因编码区序列为如seq idno.3所示的序列。seq id no.3所示的序列为papds基因cdna序列的一部分，其与trvⅱ-gfp载体连接构成重组载体后，将使得重组载体转化的个体中的papds基因转录出的mrna的相应序列被降解，papds基因不能正常表达。

8、一种加深杏果实颜色的方法，将上述的调控杏果实色泽的功能基因papds或含有调控杏果实色泽的功能基因papds基因编码区序列的重组载体转化至杏树幼苗或者杏果实。

9、上述的方法，重组载体的原始载体为pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos，papds基因编码区序列插在pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体上bsaⅰ限制性内切酶的切割位置处，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示序列。重组pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体将在杏果实中介导papds基因的过表达，提高杏果实的β-胡萝卜素含量，加深杏果实的颜色。

10、上述的方法，使用含重组pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体的gv3101农杆菌，将调控杏果实色泽的功能基因papds转化至杏树幼苗或者杏果实。

11、一种减淡杏果实颜色的方法，使用含上述重组trvⅱ-gfp载体的重组工程菌、以及含trvⅰ载体的重组工程菌共同转化杏树幼苗或杏果实。trvⅱ-gfp载体和trvⅰ载体共同用于基因沉默，其将使jty-papds基因转录出的mrna被降解，减少杏果实中β-胡萝卜素的合成，最终起到减淡杏果实颜色的目的。

12、上述的方法，含重组trvⅱ-gfp载体的重组工程菌和含trvⅰ载体的重组工程菌均为gv3101农杆菌。

13、本发明提供了从金太阳杏中克隆得到的papds基因，该基因编码的蛋白能够参与杏果实中β-胡萝卜素的合成，将该基因在杏果实中过表达可以显著加深杏果实的颜色和β-胡萝卜素的含量，可用于杏树果实颜色的遗传改良。

14、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

15、1、本发明根据β-胡萝卜素含量测定和转录组学分析结果，从“金太阳”杏的果肉总rna中逆转录并克隆得到了能够调控杏果肉颜色的jty-papds基因的全长cdna序列；进一步地，本发明利用基因工程技术，获得了含jty-papds基因的重组克隆载体和重组过表达载体，还获得了用于使jty-papds基因沉默的vigs沉默载体。将含jty-papds基因的重组过表达载体和用于使jty-papds基因沉默的vigs沉默载体分别转化杏果肉细胞后，分别增加了和减少了杏果肉细胞中的β-胡萝卜素含量，进而分别对杏果肉的颜色起到加深作用和减淡作用。

16、2、本发明中的jty-papds基因、重组过表达载体和vigs沉默载体可用于杏果肉颜色以及杏果肉中β-胡萝卜素的含量进行遗传改良，重组克隆载体可用于构建其他类型的含jty-papds基因的载体，以期对jty-papds基因的功能进行进一步的研究。

技术特征：

1.一种调控杏果实色泽的功能基因papds，其特征在于，papds基因的序列如seq idno.1所示，papds基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.含有调控杏果实色泽的功能基因papds基因编码区序列的重组载体在调控杏果实颜色中的应用，其特征在于，papds基因编码区序列为seq id no.1所示的序列或seq id no.3所示的序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为pmd19-t，papds基因编码区序列位于pmd19-t载体的salⅰ和xbaⅰ两限制性内切酶位点之间，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示的序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos，papds基因编码区序列插在pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体上bsaⅰ限制性内切酶的切割位置处，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示序列。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，重组载体的原始载体为trvⅱ-gfp，papds基因编码区序列插在trvⅱ-gfp载体的ecorⅰ和xhoⅰ两限制性内切酶位点之间，papds基因编码区序列为如seq id no.3所示的序列。

6.一种加深杏果实颜色的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的调控杏果实色泽的功能基因papds或含有调控杏果实色泽的功能基因papds基因编码区序列的重组载体转化至杏树幼苗或者杏果实。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，重组载体的原始载体为pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos，papds基因编码区序列插在pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体上bsaⅰ限制性内切酶的切割位置处，papds基因编码区序列为如seq id no.1所示序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用含重组pbwa(v)hs-osgfp-ccdb-tnos载体的gv3101农杆菌，将调控杏果实色泽的功能基因papds转化至杏树幼苗或者杏果实。

9.一种减淡杏果实颜色的方法，其特征在于，使用含如权利要求5所述的重组trvⅱ-gfp载体的重组工程菌、以及含trvⅰ载体的重组工程菌共同转化杏树幼苗或杏果实。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，含重组trvⅱ-gfp载体的重组工程菌和含trvⅰ载体的重组工程菌均为gv3101农杆菌。

技术总结
本发明公开一种调控杏果实色泽的功能基因PaPDS及其应用。PaPDS基因的序列如SEQ ID NO.1所示，PaPDS基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。转录组学分析、过表达实验和基因沉默实验证实，PaPDS基因编码的基因能够调控杏果肉中β‑胡萝卜素的含量，进而影响杏果肉的色泽，当PaPDS基因过表达时，杏果肉颜色较深。本发明为杏果肉颜色以及杏果肉中β‑胡萝卜素含量的遗传改良奠定了基础，在杏树的基因工程育种方面具有潜在的价值。

技术研发人员：乌云塔娜,苟宁宁,王淋,刘慧敏,陈晨,黄梦真,白海坤,姜楠,王楚,张钰婧,李辉
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院经济林研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27