一种检测小麦条锈病病原菌的引物对、探针、试剂盒及其应用

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种检测小麦条锈病病原菌的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、小麦条锈病(p.striiformis，pst)是由小麦条锈病菌引起的真菌性病害。被小麦条锈菌侵染的小麦叶片正面初期形成很多鲜黄色的夏孢子堆，后期孢子堆破裂，导致叶片干枯死亡。该病在全球小麦种植区均有发生，严重时可对小麦生产造成毁灭性打击。

2、目前，已报道过的小麦条锈病检测方法主要有pcr法，实时荧光定量pcr法等。但是基于pcr反应的技术需要精密的仪器、反应过程缓慢、结果的检测复杂、对专业人员技术要求较高，不适宜大规模农田推广和应用。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，rpa)技术是一种新型恒温扩增技术，其利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合，以代替传统pcr热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术，是目前最接近常温扩增的技术。并与利用胶体金免疫层析原理检测的侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，lfd)结合应用，实现可视化检测。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测小麦条锈病病原菌的引物对、探针、试剂盒及其应用。

2、第一方面，本发明提供一种引物对，包括：

3、pst-f:5'-aacatgcgtgatccaaatgccatggaaatc-3’，

4、pst-r:5'-gagacaaagagattgggacaattaagactaccg-3’。

5、进一步地，所述引物对中pst-r的5'端连接有biotin标记。

6、第二方面，本发明提供一种探针，包括：

7、5'-agcgatctgtcgggctcgaaaattgtgctttcatgcctcgctcctatcg-3'。

8、进一步地，所述探针在5'和3'携带不同荧光基团；

9、所述荧光基团优选包括fam、rox或c3 spacer中的一种或多种。

10、第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述引物对和所述探针。

11、进一步地，还包括：

12、rpa反应试剂和rpa-lfd检测试纸条。

13、进一步地，所述rpa反应试剂包括：

14、a buffer、b buffer和ddh2o。

15、进一步地，所述a buffer包括复溶缓冲液。

16、所述复溶缓冲液的主要成分为重组酶uvsx、单链结合蛋白gp32和链置换dna聚合酶bsu，以及一种辅助蛋白uvsy。

17、进一步地，所述b buffer包括醋酸镁。

18、第四方面，本发明提供所述引物对，和所述探针，和所述试剂盒在检测小麦条锈病的病原菌中的应用。

19、第五方面，本发明提供一种检测小麦条锈病的病原菌的方法，包括：

20、提取待测样品的基因组dna；采用所述的试剂盒进行检测，根据检测结果判断所述待测样品中是否包含小麦条锈病的病原菌。

21、进一步地，所述检测的过程包括：rpa反应、侧流层析和结果判读；

22、所述rpa反应的条件包括：

23、在37～41℃的条件下反应25分钟以上。

24、作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种检测小麦条锈病的病原菌的方法，包括：

25、提取待测样品的基因组dna；

26、混合a buffer、上游引物、下游引物、探针和ddh2o得到预混液；

27、混合预混液、b buffer和所述基因组dna，在38～40℃的条件下反应25～40min得到反应产物；

28、将所述反应产物稀释后，置入rpa-lfd检测试纸条，在2-5min后观察，记录控制线和检测线，判定检测结果；

29、若试纸条上显示两条带，表明该样本含有小麦条锈菌；若试纸条上只显示出一条控制线条带，表明该样本不含有小麦条锈菌。

30、本发明具有如下有益效果：

31、本发明基于新发现的小麦条锈病病原菌的一段高特异性片段提供了引物对、探针和检测试剂盒。基于本发明提供的检测试剂盒，可以对小麦叶片样品中的小麦条锈病病原菌进行快速检测，同时具备较高的特异性和灵敏度。本发明提供的检测方法不依赖复杂的实验设备，可便捷应用于现场检测诊断，试纸条检测结果可通过肉眼直接观察。同时，rpa-lfd方法为远距离、不便保存样品的检测，以及为小麦条锈病病原菌的早期预测和防治提供技术支撑。

技术特征：

1.一种引物对，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中pst-r的5'端连接有biotin标记。

3.一种探针，其特征在于，包括：

4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针在5'和3'携带不同荧光基团；

5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对和权利要求3或4所述的探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

7.权利要求1或2所述的引物对，或权利要求3或4所述的探针，或权利要求5或6所述的试剂盒在检测小麦条锈病的病原菌中的应用。

8.一种检测小麦条锈病的病原菌的方法，其特征在于，包括：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测的过程包括：rpa反应、侧流层析和结果判读；

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测小麦条锈病病原菌的引物对、探针、试剂盒及其应用。所述引物对包括：包括：PST‑F:5'‑AACATGCGTGATCCAAATGCCATGGAAATC‑3’，PST‑R:5'‑GAGACAAAGAGATTGGGACAATTAAGACTACCG‑3’。本发明发现了小麦条锈病病原菌一段235bp的PST高特异性片段，并且基于该靶点提供了引物、探针和检测试剂盒。本发明提供的引物对和探针在针对PST进行检测时具备较高的特异性和灵敏度，在检测小麦条锈病病原菌的领域具有重要价值。

技术研发人员：马占鸿,吕璇,蒋佳芮
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31