一种无血清干细胞培养基及其制备方法和应用与流程

本发明涉及干细胞培养，具体是一种无血清干细胞培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人胎盘间充质干细胞在临床领域得到管饭应用并取得显著的治疗效果。干细胞扩增数量、活率以及无外源性污染是影响人胎盘间充质干细胞在临床治疗应用的疗效与安全的重要参数。常规用于培养人胎盘间充质干细胞的培养基中常含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞分化形成干扰。除了不明确的细胞因子影响外，常规的培养基中通常添加有动物血清，采用含动物血清的培养基培养得到的人胎盘间充质干细胞在临床应用中，可能会引起病原体的交叉感染，因此为得到更好的干细胞扩增数量及良好活率，且无外源性顾虑，开发尽可能成分明确的无血清培养基在当下干细胞培养中具有迫切需求。

2、目前，市场上用于培养人胎盘间充质干细胞的无血清干细胞培养基比较少，且采用现有的无血清干细胞培养基进行培养，在种子细胞复苏后的后续培养时会出现生长缓慢与分化的现象，影响了干细胞的自我增殖，在一定程度上阻碍了人胎盘间充质干细胞的临床治疗应用，因此现有的无血清培养体系及其配套培养方法具有较大的更新与改善的空间。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提出一种无血清干细胞培养基，适用于对人胎盘间充质干细胞进行培养，在避免引入动物源性物质带来的污染风险下，能有效提高人胎盘间充质干细胞的生长速率和存活率，且能够防止或减少了人胎盘间充质干细胞在培养后出现的分化和表型改变的问题。

2、本发明的另一目的在于提出一种无血清干细胞培养基的制备方法，能够制备无血清且适用于人胎盘间充质干细胞的无血清干细胞培养基。

3、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的添加物，按所述无血清干细胞培养基的总体积计，所述添加物包括人转铁蛋白2～11μg/ml、重组表皮细胞生长因子5～30ng/ml、还原型谷胱甘肽1～5μg/ml、转化生长因子β5～20ng/ml、生物素0.1～9μg/ml、积雪草提取物6～25μg/ml、小白菊提取物5～20ng/ml和倒扣草提取物50～170μg/ml。

5、优选地，按所述无血清干细胞培养基的总体积计，所述添加物还包括重组人胰岛素2～9μg/ml、人血清白蛋白1～4mg/ml和维生素c1～45μg/ml。

6、优选地，所述基础培养基为d-mem/f-12培养基。

7、一种无血清干细胞培养基的制备方法，用于上述的无血清干细胞培养基，包括以下步骤：

8、(1)使用干燥积雪草作为原料，进行提取，得到积雪草提取物；

9、(2)使用干燥小白菊粉末作为原料，进行提取，得到小白菊提取物；

10、(3)使用干燥倒扣草作为原料，进行提取，得到倒扣草提取物；

11、(4)按各组分在基础培养基中的添加量，将人转铁蛋白、重组表皮细胞生长因子、还原型谷胱甘肽、转化生长因子β、积雪草提取物、倒扣草提取物和小白菊提取物添加至基础培养基中，得到无血清干细胞培养基。

12、优选地，在步骤(1)中，积雪草提取物的提取方法包括如下步骤：将干燥积雪草粉碎后，加入15～25倍量水，在温度为40～50℃的条件下进行提取，在指定时间后加水稀释至提取前的体积，得到积雪草粗提液；对积雪草粗提液依次进行分离纯化和真空冷冻干燥处理，得到积雪草提取物。

13、优选地，在步骤(2)中，小白菊提取物的提取方法包括如下步骤：向干燥欧洲小白菊粉末中加入浓度为70％的甲醇，进行微波提取，在指定时间后挥干甲醇，得到小白菊浸膏，对小白菊浸膏进行真空冷冻干燥处理，得到小白菊提取物。

14、优选地，在步骤(3)中，倒扣草提取物的提取方法包括如下步骤：向干燥倒扣草中加入浓度为80％的甲醇进行超声提取，在指定时间后过滤，挥干滤液中的甲醇，得到倒扣草浸膏，将倒扣草浸膏进行真空冷冻干燥处理，得到倒扣草提取物。

15、上述的无血清干细胞培养基，在人胎盘间充质干细胞体外培养中应用。

16、本申请实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：本技术方案的无血清干细胞培养基中添加有人转铁蛋白2～11μg/ml、重组表皮细胞生长因子5～30ng/ml、还原型谷胱甘肽1～5μg/ml、转化生长因子β5～20ng/ml、生物素0.1～9μg/ml、积雪草提取物6～25μg/ml、小白菊提取物5～20ng/ml和倒扣草提取物50～170ug/ml，通过多组分协同作用在避免引入动物源性物质带来的污染风险下，相比常规无血清培养基，具有更好的维持细胞形态效果，且能在收获时得到数量更多、活率更高的间充质干细胞，以更好地进行传代或冻存，而且本技术方案的无血清干细胞培养基在促进干细胞扩增的同时，能够有效防止或减少了间充质干细胞的分化和表型改变的问题。

技术特征：

1.一种无血清干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在基础培养基中的添加物；按所述无血清干细胞培养基的总体积计，所述添加物包括人转铁蛋白2～11μg/ml、重组表皮细胞生长因子5～30ng/ml、还原型谷胱甘肽1～5μg/ml、转化生长因子β5～20ng/ml、生物素0.1～9μg/ml、积雪草提取物6～25μg/ml、小白菊提取物5～20ng/ml和倒扣草提取物50～170μg/ml。

2.根据权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，按所述无血清干细胞培养基的总体积计，所述添加物还包括重组人胰岛素2～9μg/ml、人血清白蛋白1～4mg/ml和维生素c1～45μg/ml。

3.根据权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为d-mem/f-12培养基。

4.一种无血清干细胞培养基的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求1-3任一项所述的无血清干细胞培养基，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的无血清干细胞培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，积雪草提取物的提取方法包括如下步骤：将干燥积雪草粉碎后，加入15～25倍量水，在温度为40～50℃的条件下进行提取，在指定时间后加水稀释至提取前的体积，得到积雪草粗提液；对积雪草粗提液依次进行分离纯化和真空冷冻干燥处理，得到积雪草提取物。

6.根据权利要求4所述的无血清干细胞培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，小白菊提取物的提取方法包括如下步骤：向干燥欧洲小白菊粉末中加入浓度为70％的甲醇，进行微波提取，在指定时间后挥干甲醇，得到小白菊浸膏，对小白菊浸膏进行真空冷冻干燥处理，得到小白菊提取物。

7.根据权利要求4所述的无血清干细胞培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，倒扣草提取物的提取方法包括如下步骤：向干燥倒扣草中加入浓度为80％的甲醇进行超声提取，在指定时间后过滤，挥干滤液中的甲醇，得到倒扣草浸膏，将倒扣草浸膏进行真空冷冻干燥处理，得到倒扣草提取物。

8.根据权利要求1-3任一项所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，在人胎盘间充质干细胞体外培养中应用。

技术总结
本发明公开了一种无血清干细胞培养基及其制备方法和应用，涉及干细胞培养技术领域。本发明的无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的添加物，按所述无血清干细胞培养基的总体积计，添加物包括人转铁蛋白2～11μg/mL、重组表皮细胞生长因子5～30ng/mL、还原型谷胱甘肽1～5μg/mL、转化生长因子β5～20ng/mL、生物素0.1～9μg/mL、积雪草提取物6～25μg/mL、小白菊提取物5～20ng/mL和倒扣草提取物50～170μg/ml。本发明的无血清干细胞培养基适用于对人胎盘间充质干细胞进行培养，在避免引入动物源性物质带来的污染风险下，能有效提高人胎盘间充质干细胞的生长速率和存活率，且能够防止或减少了人胎盘间充质干细胞在培养后出现的分化和表型改变的问题。

技术研发人员：许峻荣,王永立,罗春婷,吴远武,陈智聪,麦凯琳,魏鲁宁,王进辉
受保护的技术使用者：广东唯泰生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31