一种带His标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法与流程

本发明属于透明质酸酶制备，具体地说，涉及一种带his标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法。

背景技术：

1、透明质酸酶(hyaluronidase，haase)是一种可以降解透明质酸(hyaluronicacid)和部分糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)的一类糖苷酶。在医疗和美容等领域发挥着重要的作用，在医疗领域已被美国食品药品监督管理局(food and drugadministration，fda)批准可作为一种佐剂促进其他药物的吸收和扩散，也可做为麻醉辅助剂使用。在整形美容领域作为一种理想的软组织填充剂，被广泛使用。

2、目前经fda批准上市的药品来自于动物睾丸和人工重组，前者从牛，羊等睾丸中提取，后者则是将人透明质酸酶的序列导入细胞中培养而来，前者具有纯度低和高免疫原性等缺点，后者则分离和纯化困难。因此，近年来透明质酸酶的研究成为一个热点。

3、鉴于此，特提出此发明，一种带his标签的重组人透明质酸酶的分离纯化技术，旨在解决重组人透明质酸酶分离纯化困难的问题。

技术实现思路

1、为解决重组透明质酸酶分离纯化困难这一问题，本发明的目的在于提供一种带his标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法，该方法可操作性强，重复性好，可获得高纯度、高活性的重组人透明质酸酶蛋白。

2、为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：

3、本发明的带his标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法，包括以下步骤：

4、(1)将含有带his标签的重组人透明质酸酶的细胞上清液进行亲和层析并收集洗脱峰，所述带his标签的重组人透明质酸酶包括重组人透明质酸酶蛋白、与重组人透明质酸酶蛋白的一端依次连接的sumo蛋白酶酶切位点、his6标签；

5、(2)对步骤(1)收集的洗脱峰进行酶切，得酶切液；

6、(3)对酶切液进行亲和层析并收集流穿峰；

7、(4)对步骤(3)收集的流穿峰进行阳离子交换层析并收集洗脱峰。

8、为降低成本，优选的，步骤(1)以及步骤(3)中亲和层析采用ni focurose ff亲和层析柱。优选的，步骤(4)中阳离子交换层析采用maxtar sp hr层析柱。

9、酶切过程将his6标签以及sumo蛋白酶酶切位点去除，优选的，酶切过程包括sumo蛋白酶与带his标签的重组人透明质酸酶混合进行消化反应。酶切时所用sumo蛋白酶的量以及消化反应时间以及温度均可以根据sumo蛋白酶的活性进行调整，只要能实现完全酶切即可。进一步优选的，酶切过程包括：在洗脱峰中加入sumo蛋白酶进行消化反应，消化反应时sumo蛋白酶与带his标签的重组人透明质酸酶的质量比为1：1，消化反应时温度为25～35℃。

10、步骤(1)中亲和层析时用含20mm pb，150mm nacl，50mm咪唑(imd)的洗脱液进行等度洗脱，所述洗脱液的ph值为7.2±0.2。

11、步骤(1)中亲和层析时所用平衡缓冲液含20mm pb，150mm nacl，10mm imd，平衡缓冲液的ph值为7.2±0.2。

12、步骤(3)中亲和层析时所用平衡缓冲液含20mm pb，150mm nacl，平衡缓冲液的ph值为7.2±0.2。

13、优选的，步骤(4)中阳离子交换层析时采用的含20mm naac-hac，160mm nacl的洗脱液等度洗脱，所述洗脱液的ph值为5.0±0.2。

14、本发明的分离纯化方法中，经过阳离子交换层析后收集到的洗脱峰过滤后即得高纯度、高活性得重组人透明质酸酶蛋白。优选的，过滤时使用millex-gp syringe filterunit(pes，0.22μm)滤膜。

15、有益效果：本发明通过采用his6标签以及sumo酶切位点，利用特异性结合来高效纯化重组人透明质酸酶。其中his标签分子量小，易于表达，对重组蛋白的性质影响很小，设计sumo酶切位点与目的蛋白融合表达，增强可溶性表达的同时含有特定gly-gly识别序列，可被sumo蛋白酶特异性识别切割。另外sumo蛋白酶与其他蛋白酶相比能耐受更高的常见缓冲液化学成分，如本发明中从ni focurose ff(ted)洗脱得到含高浓度咪唑的目的蛋白溶液中可直接加入sumo蛋白酶进行切割，而使用其他蛋白酶可能需要先进性脱盐或者超滤换液后在进行酶切，可以达到简化纯化步骤，提高重组人透明质酸酶纯度和活性，同时可操作性强，重复性好，可用于大规模生产。

技术特征：

1.一种带his标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)以及步骤(3)中亲和层析采用ni focurose ff亲和层析柱。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中阳离子交换层析采用maxtar sp hr层析柱。

4.根据权利要求1～3任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中酶切过程包括：sumo蛋白酶与带his标签的重组人透明质酸酶混合进行消化反应。

5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中酶切过程包括：在洗脱峰中加入sumo蛋白酶进行消化反应，消化反应时sumo蛋白酶与带his标签的重组人透明质酸酶的质量比为1：1，消化反应时温度为25～35℃。

6.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中亲和层析时用含20mm pb，150mm nacl，50mm咪唑的洗脱液进行等度洗脱，所述洗脱液的ph值为7.2±0.2。

7.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中亲和层析时所用平衡缓冲液含20mm pb，150mm nacl，10mm咪唑，平衡缓冲液的ph值为7.2±0.2。

8.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中亲和层析时所用平衡缓冲液含20mm pb，150mm nacl，平衡缓冲液的ph值为7.2±0.2。

9.根据权利要求1或3所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中阳离子

技术总结
本发明公开了一种带His标签的重组人透明质酸酶的分离纯化方法，该分离纯化方法包括：将含有带His标签的重组人透明质酸酶的细胞上清液进行亲和层析并收集洗脱峰，所述带His标签的重组人透明质酸酶包括重组人透明质酸酶蛋白、与重组人透明质酸酶蛋白的一端依次连接的sumo蛋白酶酶切位点、His6标签；对收集的洗脱峰对应的洗脱液进行酶切，得酶切液；对酶切液进行亲和层析并收集流穿峰；对收集的流穿峰进行阳离子交换层析收集洗脱峰。本发明的分离纯化方法可操作性强、重复性好，可获得高纯度、高活性的重组人透明质酸酶蛋白。

技术研发人员：段欢欢,董育亮,赵丽晶,杨泗兴,翁志兵,娄竞
受保护的技术使用者：上海晟国医药发展有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10