油菜基因BnaGH3及其在油菜菌核病防控中的应用

本发明属于植物生物，具体涉及甘蓝型油菜bnagh3基因及其在油菜菌核病防控中的应用。

背景技术：

1、油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是我国传统的油料作物，是我国重要的食用油来源。油菜在生长发育过程中会遭受多种病虫的侵害，其中菌核病是最常见的病害。菌核病是由核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)侵染引起的一种世界性病害，严重制约油菜的高产与稳产。近年来，随着生态条件的变化以及双低油菜的大面积推广，油菜菌核病发病率呈现加重的趋势。我国平均每年保持10％～30％的菌核病发病率，在高发病年份，田间植株发病率达到80％以上。菌核病造成我国油菜减产10％～20％，重病年高达70％。感染菌核病后，油菜籽的含油量和品质显著下降。

2、目前，在油菜乃至整个十字花科植物中还未找到对菌核病完全免疫的种质资源，这给菌核病抗病品种选育带来了极大的挑战，阻碍了油菜抗病育种进程。此外，目前对油菜应答核盘菌感染的信号通路和基因的挖掘十分有限，对植物体响应该病原菌潜在的分子机制尚不清楚。因此进一步对油菜响应核盘菌感染的作用机制进行阐述，全面了解病原菌危害时植物体的应答模式尤为重要，为揭示油菜核盘菌互作模式提供理论依据，并为菌核病抗性的改良提供指导。

3、crispr/cas9技术被成功开发及应用于动物细胞的基因编辑后，也被迅速应用到植物中。目前，crispr/cas9技术已可用于小麦、柳枝稷、大豆和草莓等多倍体作物性状的遗传改良。因此，利用高效的crispr/cas9技术获得油菜突变体，不仅有助于油菜基因功能的研究，也为将来油菜基因工程遗传改良提供新方向。

技术实现思路

1、鉴定关键的抗菌核病调控基因，通过生物技术创制并合理利用抗病品种，对于油菜菌核病的防控与绿色发展有十分重要的意义。基于此，本发明提供了一种新的油菜抗菌核病基因，油菜bnagh3基因，并研究了其在油菜抗菌核病中的作用。

2、本发明以油菜westar品种的cdna为模板，通过pcr克隆获得油菜基因bnagh3的全长，该基因的开放阅读框(orf)长1854bp，核酸序列如seq id no.1所示，编码的蛋白由617个氨基酸组成，编码的蛋白序列如seq id no.2所示。

3、本发明通过基因编辑油菜基因bnagh3获得了纯合突变转基因油菜，发现该转基因油菜在对菌核病抗性发生了改变。其中基因编辑获得纯合突变转基因油菜通过以下步骤实现：

4、(1)sgrna靶点选择及crispr/cas9载体(crispr/cas9-bnagh3)的成功构建。设计靶向bnagh3基因的sgrna，将该序列克隆到crispr/cas9载体上；其中sgrna序列如seq idno.3所示，bnagh3基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示；

5、(2)农杆菌的获取。将基因突变表达载体crispr/cas9-bnagh3通过电击转化转入对油菜具有强侵染力的农杆菌菌株gv3101，在含卡那霉素的lb固体培养基上筛选，通过pcr和测序鉴定，获取携带bnagh3基因的农杆菌，用于下一步油菜的遗传转化。

6、(3)甘蓝型油菜bnagh3突变体的获得。通过农杆菌侵染油菜下胚轴的方式将上述农杆菌载体转入油菜，获得转基因油菜植株，具体步骤如下：

7、a.种子灭菌与播种。挑选饱满的westar油菜种子消毒后放入无菌盒中，25℃培养5-6天。

8、b.外植体的制备与侵染。用含有kan抗性lb液体培养基培养目标菌株。28℃，220rpm过夜摇至菌液od600为0.6。将下胚轴分切为0.8-1.0cm长度。将重悬的菌液倒入装有下胚轴的培养皿中，侵染10min。将下胚轴转到装有滤纸的培养皿中，放置20-30min后转到m1培养基中,在25℃条件下培养2d。

9、c.选择诱导愈伤组织。将m1培养基中的外植体转移到m2培养基中，在25℃，培养两周。

10、d.诱导分化与芽再生、生根。将m2培养基中的愈伤组织转移到m3培养基，若出现绿色的芽，用无菌刀片切下组织，转入m4培养基，生根。

11、e.甘蓝型油菜bnagh3纯合突变体的筛选及鉴定。设计突变株鉴定引物，对阳性植株dna进行扩增、片段回收进行测序检测。将测序结果序列与原始序列进行比对，分析其突变类型及突变位点，其中突变株鉴定引物序列如seq id no.4所示。

12、可以以获取的bnagh3基因油菜纯合突变株系为材料，通过接种核盘菌，检测分析其对油菜菌核病的抗性，从而明确bnagh3基因对油菜菌核病抗性的调控作用。

13、在本发明之前，该基因的功能没有任何公开报告。本发明首次通过构建该基因的基因突变载体敲除bnagh3，获得了单基因突变油菜，分析其抗病性，阐明了该基因对油菜菌核病抗性的调控作用及机制。与非转基因野生型对照植株相比，单基因突变体抗菌核病的能力降低，对核盘菌更感病，说明bnagh3强烈正调控油菜对核盘菌的抗性。

14、本发明提供的bnagh3基因是优质抗菌核病调控基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强等优点。bnagh3基因是免疫受体基因，是抗病信号传导的门控基因，因此，抗性调控效果好，是优质抗病调控基因资源。

15、有益效果

16、油菜菌核病抗性是数量性状抗性，由多基因控制。一般而言，单个基因对该抗性的调控程度较低。因此，全世界范围内，油菜菌核病抗性材料都很匮乏，尚无稳定的高抗材料。而本发明通过筛选发现了bnagh3基因，对于油菜菌核病的防治和抗病品种的培育都有重要的意义。利用bnagh3创制抗病品种和种质是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。bnagh3基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的全新基因资源。

17、获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用茉莉酸异亮氨酸合成酶基因bnagh3，采用基因工程方法，创制培育油菜材料，具有周期短，选育快速等特点。

技术特征：

1.一种甘蓝型油菜抗核盘菌基因bnagh3，其特征在于，bnagh3基因的开放阅读框(orf)长1854bp，编码的蛋白由617个氨基酸组成，bnagh3基因的核酸序列如seq id no.1所示，编码的蛋白序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的bnagh3基因在甘蓝型油菜菌核病防控中的应用，其特征在于，上调bnagh3基因在甘蓝型油菜中的表达，以达到抗菌核病的效果，所述菌核病是由核盘菌感染导致。

3.一种筛选抗菌核病油菜的方法，其特征在于，检测油菜中的bnagh3基因，如果油菜中出现了bnagh3纯合表型，则该品种的抗菌核病的能力较差。

4.一种油菜bnagh3基因纯合突变转基因植株的制备方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：

技术总结
本发明属于植物生物技术领域，具体的，本发明提供了油菜基因BnaGH3及其在油菜菌核病抗性中的调控作用。本发明通过基因编辑技术敲除油菜BnaGH3基因，获得了BnaGH3的纯合突变体，通过接种核盘菌，检测分析其对油菜菌核病的抗性，明确了BnaGH3基因对油菜菌核病抗性的正调控作用。基于本发明的研究结果，可以构建该基因的转基因载体、采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料。本发明对于油菜菌核病防治具有重要的意义以及应用价值，可以用于油菜新品种的育种中。

技术研发人员：张华建,孙敏,刘英军,陈姣,朱宗河,张婷,葛莎婷,余燕
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31