生物膜分散调控基因spo0J敲除片段及其应用

本发明属于微生物基因工程，更具体地说，涉及生物膜分散调控基因spo0j敲除片段及其应用。

背景技术：

1、瓦雷兹芽孢杆菌(bacillus velezensis)fzb42是一株革兰氏阳性植物根际促生菌，它在1998年从德国甜菜根际分离并在2007年作为第一株解淀粉芽孢杆菌进行了全基因组测序。fzb42已经商品化，其以生物膜方式定殖于植物根部并促进植物生长。细菌生物膜的发育是一个复杂的循环过程，包括初始附着、形成、成熟和分散等环节。除了形成生物膜帮助定殖外，fzb42还可以合成吲哚乙酸(吲哚乙酸(iaa))促进植物生长。fzb42作为一株植物根际促生菌拥有广泛的应用前景，因此分析其生防机理具有深远的意义。

2、fzb42已完成全基因组测序，这为筛选生物膜调控基因提供了前提。鉴于生物膜对fzb42定殖是发挥其促生功能的关键因素，因此筛选fzb42生物膜调控基因有助于发掘其促生价值。

3、spo0j是在枯草芽孢杆菌中与细菌中的质粒和染色体分离有关的蛋白，属于parabs系统。

4、作为parabs系统的一部分，soj(para)和spo0j(parb)参与控制细菌细胞周期的其他关键方面。在枯草芽孢杆菌中，soj的二聚体和单体形式分别激活或抑制dna复制。此外，spo0j被确定为smc复合体的特异性负载因子，smc复合体也称为condensin(最初在枯草芽孢杆菌中，最近在一系列其他细菌中)smc/condensin从细菌到人类是保守的，在枯草芽孢杆菌中，是染色体的主要组织者：在起点装载后，smc复合物利用atp酶活性向末端转移，同时在促进大量染色体分离的过程中排列染色体臂，直到终点处专门卸载。soj和spo0j还参与了芽孢形成的早期阶段：通过激活检查点调节因子，参与染色体重组装和分离。研究表明para/soj和parb/spo0j在细菌中参与染色体分离和芽孢形成，然而有关于其在生物膜分散中的研究未见任何报导。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供瓦雷兹芽孢杆菌fzb42 spo0j基因，用于构建转基因菌株；本发明所要解决的另一技术问题在于提供瓦雷兹芽孢杆菌fzb42 spo0j基因的应用，用于筛选优良促生菌株。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、生物膜分散调控基因spo0j敲除片段，其核苷酸序列如seq id no.3所示；所述生物膜分散调控基因spo0j的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用，包括以下步骤：

5、(1)构建生物膜分散调控基因spo0j的敲除片段；

6、(2)将所构建的生物膜分散调控基因spo0j的敲除片段转化到瓦雷兹芽孢杆菌fzb42中；

7、(3)培育筛选得到吲哚乙酸分泌水平显著提高的瓦雷兹芽孢杆菌fzb42。

8、所述生物膜分散调控基因spo0j敲除片段的构建方法为：基于生物膜分散突变文库，通过反向pcr鉴定得到生物膜调控基因spo0j，通过重叠pcr获得敲除spo0j基因的目的片段，即生物膜分散调控基因spo0j的敲除片段。

9、所述反向pcr引物序列如下：

10、fbo752-f：5’-gcttgtaaattctatcataattg-3’，

11、fbo753-r：5’-agggaatcatttgaaggttgg-3’。

12、生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进色氨酸合成基因表达中的应用。

13、所述色氨酸合成基因为trpb、trpc。

14、生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进吲哚乙酸合成基因表达中的应用。

15、所述吲哚乙酸合成基因为ysne。

16、生物膜分散调控基因spo0j在抑制瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸和/或抑制色氨酸合成基因表达和/或抑制吲哚乙酸合成基因表达中的应用；所述色氨酸合成基因为trpb、trpc；所述吲哚乙酸合成基因为ysne。

17、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

18、1)本发明基于生物膜分散突变文库，反向pcr鉴定得到生物膜调控基因spo0j，通过重叠pcr获得敲除spo0j基因的目的片段，将该片段通过化学转化的方法导入野生型fzb42菌株得到spo0j敲除株△spo0j。

19、2)本发明△spo0j菌株与野生型fzb42相比，生物膜分散能力缺失。

20、3)本发明△spo0j菌株与野生型fzb42相比，分泌吲哚乙酸(iaa)的水平显著提高。

21、4)本发明△spo0j菌株与野生型fzb42相比，色氨酸合成基因trpb、trpc及吲哚乙酸(iaa)合成基因ysne的相对表达水平均显著上升。

技术特征：

1.生物膜分散调控基因spo0j敲除片段，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.权利要求1所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用，其特征在于，所述生物膜分散调控基因spo0j敲除片段的构建方法为：基于生物膜分散突变文库，通过反向pcr鉴定得到生物膜调控基因spo0j，通过重叠pcr获得敲除spo0j基因的目的片段，即生物膜分散调控基因spo0j的敲除片段。

5.权利要求4所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸中的应用，其特征在于，所述反向pcr引物序列如下：

6.权利要求1所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进色氨酸合成基因表达中的应用。

7.根据权利要求6所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进色氨酸合成基因表达中的应用，其特征在于，所述色氨酸合成基因为trpb、trpc。

8.权利要求1所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进吲哚乙酸合成基因表达中的应用。

9.根据权利要求8所述的生物膜分散调控基因spo0j敲除片段在促进吲哚乙酸合成基因表达中的应用，其特征在于，所述吲哚乙酸合成基因为ysne。

10.权利要求1所述的生物膜分散调控基因spo0j在抑制瓦雷兹芽孢杆菌fzb42分泌吲哚乙酸和/或抑制色氨酸合成基因表达和/或抑制吲哚乙酸合成基因表达中的应用；所述色氨酸合成基因为trpb、trpc；所述吲哚乙酸合成基因为ysne。

技术总结
本发明公开了生物膜分散调控基因spo0J敲除片段及其应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明的生物膜分散调控基因spo0J敲除片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过重叠PCR获得敲除spo0J基因的目的片段，即生物膜分散调控基因spo0J的敲除片段；将该片段通过化学转化的方法转化进野生型FZB42得到spo0J敲除株△spo0J。△spo0J菌株与野生型FZB42相比，分泌吲哚乙酸(IAA)的水平显著提高；色氨酸合成基因trpB、trpC及吲哚乙酸(IAA)合成基因ysnE的相对表达水平均显著上升。

技术研发人员：赵银娟,邵林,樊奔
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10