一种美国白蛾性信息素的酶工艺合成方法与流程

本发明涉及一种美国白蛾性信息素的酶工艺合成方法，属于农药合成。

背景技术：

1、(9z,12z)-9,12-octadecadienal，化学名为9z，12z-十八碳二烯醛，分子式为c18h32o；cas登记号：2541-61-9。9z，12z-十八碳二烯醛是1982年有hill课题组鉴定的美国白蛾性信息素主要有效成分之一。美国白蛾是国际性检疫害虫，1990年被林业部列为中国七大森林害虫之一。昆虫性信息素作为测报手段和防治技术，可应用在种群动态监测、疫区扩散蔓延趋势监测、防治效果检查及大量诱杀等方面。研究表明，美国白蛾性信息素具有专一性强、灵敏度高、对天敌无害、不污染环境等优点，有着极高的推广价值及广阔的应用前景。

2、然而现有美国白蛾性信息素通过化学方法合成时存在如下不足：选择性低，非常容易过度氧化，反应时间长，操作过程安全隐患大，进而造成难以大规模工业化生产。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供一种美国白蛾性信息素的酶工艺合成方法，目的在于解决现有化学合成9z，12z-十八碳二烯醛的方法选择性地，容易过度氧化，反应时间长，操作过程安全隐患大，进而造成难以大规模工业化生产的技术问题。

2、本发明提供的第一个技术方案为羧酸还原酶的突变体，所述突变体是将羧酸还原酶亲本的第274位精氨酸突变为赖氨酸获得，或者是将羧酸还原酶亲本的第394位亮氨酸突变为甘氨酸获得，

3、在某些实施方式中，所述羧酸还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明提供的第二个技术方案为编码第一个技术方案所述突变体的基因。

5、本发明提供的第三个技术方案为携带第二个技术方案所述基因的重组质粒。

6、本发明提供的第四个技术方案为表达第一个技术方案所述突变体，或含有第二个技术方案所述基因或第三个技术方案所述基因的宿主细胞。

7、本发明提供的第五个技术方案为一种9z，12z-十八碳二烯醛的制备方法，所述方法以亚油酸为底物，利用halo-car酶作为催化剂组成催化体系，催化合成9z，12z-十八碳二烯醛，所述halo-car酶由羧酸还原酶(car)或第一个技术方案所述突变体、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(pptase)和谷氨酸脱氢酶(gdh)组成。

8、在某些实施方式中，所述催化体系中，亚油酸的浓度为0.003-0.020mmol/ml。亚油酸溶解在1mmol/l的dmso储备液中。

9、在某些实施方式中，所述催化体系中，halo-car酶质量与所述亚油酸的物质的量之比为1:50～150。

10、在某些实施方式中，所述催化体系中，所述car酶、所述pptase酶、所述gdh酶的浓度分别为0.50-2.00mg/ml、0.10-0.40mg/ml、0.05-0.20mg/ml。

11、在某些实施方式中，所述halo-car酶中，所述car酶、所述pptase酶、所述gdh酶的质量比为(10～20):(2～4):1。

12、在某些实施方式中，所述催化体系还包括coa、硫酸镁、atp、葡萄糖和nadp+。

13、进一步，所述coa、所述硫酸镁、所述atp、所述葡萄糖、所述nadp+与halo-car酶的质量比为(5～15)：(50～150)：(120～180)：(500～700)：(5～15)：1，优选为(8～12)：(80～120)：()130～170：(550～750)：(8～12)：1。

14、在某些实施方式中，所述催化体系还包括pbs缓冲液。

15、在某些实施方式中，所述催化的反应温度为20-30℃，反应ph为5.0-8.0。

16、本发明提供的第六个技术方案为第一个技术方案所述的突变体，或者第五个技术方案所述的方法在制备含美国白蛾性信息素的产品中的应用。

17、本发明的有益效果如下：本发明提供的制备9z，12z-十八碳二烯醛的方法，采用廉价易得的原料通过酶催化的方式还原羧酸一步到醛，9z，12z-十八碳二烯醛的纯度达到80％以上，合成路线非常简单，反应条件温和，合成工艺简洁，可用于工业化生产。

技术特征：

1.羧酸还原酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将羧酸还原酶亲本的第274位精氨酸突变为赖氨酸获得，或者是将羧酸还原酶亲本的第394位亮氨酸突变为甘氨酸获得。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述羧酸还原酶亲本的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因或权利要求4所述基因的宿主细胞。

6.一种9z，12z-十八碳二烯醛的制备方法，其特征在于，所述方法以亚油酸为底物，利用halo-car酶作为催化剂组成催化体系，催化合成9z，12z-十八碳二烯醛，所述halo-car酶由羧酸还原酶或权利要求1或2所述突变体、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和谷氨酸脱氢酶组成。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化体系中，亚油酸的浓度为0.003-0.020mmol/ml，halo-car酶质量与所述亚油酸的物质的量之比为1:50～150。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化体系还包括coa、硫酸镁、atp、葡萄糖和nadp+，所述coa、所述硫酸镁、所述atp、所述葡萄糖、所述nadp+与halo-car酶的质量比为(5～15)：(50～150)：(120～180)：(500～700)：(5～15)：1，优选为(8～12)：(80～120)：()130～170：(550～750)：(8～12)：1。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，，所述催化的反应温度为20-30℃，反应ph为5.0-8.0。

10.权利要求1或2所所述的突变体，或者权利要求6～9任一项所述的方法在制备含美国白蛾性信息素的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种美国白蛾性信息素的酶工艺合成方法，属于农药合成技术领域。本发明提供的制备9Z，12Z‑十八碳二烯醛的方法，采用廉价易得的原料通过酶催化的方式还原羧酸一步到醛，9Z，12Z‑十八碳二烯醛的纯度达到80％以上，合成路线非常简单，反应条件温和，合成工艺简洁，可用于工业化生产。

技术研发人员：胡剑锋,沈学锋,谭成侠,肖文斌,鞠志冉
受保护的技术使用者：浙江世佳科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7