体外蛋白合成的监测的制作方法

发明领域本文提供用于以装置检测蛋白合成的方法和组合物。所述方法适用于在微流体装置上的监测。

背景技术：

0、发明背景

1、当在微流体装置，诸如数字微流体装置中以微流体规模进行无细胞蛋白合成时，实时检测由所述无细胞蛋白合成反应合成的蛋白是有用的。然而，在无细胞蛋白合成反应环境中进行蛋白的实时检测是困难的。反应含有高浓度的许多其它蛋白和生物分子，使得通过标准的蛋白染色方法(例如考马斯亮蓝g-250、syprotm ruby、银染色)的非特异性蛋白检测困难。免疫染色或基于亲和力的纯化接着进行非特异性蛋白染色同样无济于事，因为必须在固体支持物上进行大量洗涤以防止背景干扰。由于已知在微流体和数字微流体装置中洗涤是困难的，背景干扰可能变得令人困扰。

2、目前现有的发光互补方法不能在无细胞蛋白合成反应中实现长期的实时检测，无细胞蛋白合成反应往往超过16小时。这种限制是由于多种原因造成的，包括与无细胞蛋白合成o2需求相竞争的发光酶的o2消耗以及在重组蛋白表达检测的3-24小时内发光底物的暂时或永久耗尽。

3、所关注的蛋白也可以表达为与荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(gfp)的融合体。然而，gfp是26.9kda的蛋白，这是大多数荧光蛋白的典型尺寸。该尺寸的标签增加所关注的蛋白的总尺寸，特别是如果所关注的蛋白必须用其它大的融合蛋白，诸如42.5kda的麦芽糖结合蛋白(mbp)标记。鉴于人蛋白的平均尺寸是约52kda，并且大肠杆菌蛋白的平均尺寸是约35kda(kim，y.e.等人，annu.rev.biochem.2013.82：323-355)，添加尺寸相当的荧光蛋白标签会显著改变蛋白的生物功能和生物物理特性。

4、许多现有技术公开子组分标签用于监测细胞系统中的表达的用途。例如，us7,666,606公开使用微结构域的蛋白-蛋白相互作用的检测系统。

5、schinn等人，biotechnol.bioeng 114102017年10月，2412-2417(https：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.26305)公开快速体外筛选非天然氨基酸对蛋白表达和活性的位置依赖性影响-schinn-2017-biotechnology and bioengineering-wiley online library。

6、分开的(split)绿色荧光蛋白(gfp)已被用于多种应用。ccgfp是一种由在红宝石香菇珊瑚(corynactis californica)中发现的四聚体gfp工程化而成的分开的绿色荧光蛋白，红宝石香菇珊瑚是一种类似于海葵和石珊瑚(scleractinianstonycorals)的鲜红色的集群的珊瑚虫，如nguyen等人；nature scientific reportsvolume 11，article number：18440(2021)中所述。本发明人在本文中已经优化了ccgfp用于无细胞蛋白合成的用途。

技术实现思路

0、概述

1、在此，我们报告令人惊讶的发现：分开的肽系统可被工程化成对无细胞蛋白合成反应中所关注的蛋白的表达进行原位、基于荧光的监测。监测可以在表达过程期间在装置上进行，因此可以实时使用或作为终点测量。

2、本文公开一种用于实时监测体外蛋白合成的方法，其包括

3、a.体外转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和

4、b.使用其它多肽监测肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签存在下产生可检测信号。

5、本文公开一种用于监测数字微流体装置上的液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括

6、a.无细胞转录和翻译与肽标签融合的所关注的蛋白；和

7、b.使用其它多肽监测肽标签的存在，所述其它多肽在所述肽标签存在下产生可检测信号。

8、本文公开一种用于监测数字微流体装置上的液滴中的无细胞蛋白合成的方法，其包括

9、a.无细胞转录和翻译与ccgfp11肽标签融合的所关注的蛋白；和

10、b.使用另外的ccgfp1-10多肽监测肽标签的存在，所述另外的ccgfp1-10多肽在所述ccgfp11肽标签存在下产生可检测信号。

11、术语“体外”和“无细胞”的使用在本文可互换使用。

12、可检测信号可以是例如荧光或发光。可检测信号也可以由配体与融合到所关注的蛋白的互补寡肽、肽或多肽标签的结合造成。

13、可检测信号也可由多肽与融合到his标签的所关注的蛋白的结合造成。

14、可以使用任何体外转录和翻译，例如来源于兔网状细胞裂解物、人裂解物、中国仓鼠卵巢裂解物、小麦胚芽、hek293裂解物、大肠杆菌裂解物、酵母裂解物的基于提取物的系统。

15、供选择地，体外转录和翻译可由纯化的组分，例如纯化重组元件系统(pure)组装。

16、体外转录和翻译可以是偶联的或不偶联的。

17、肽标签可以是荧光蛋白的一个组分，并且其它多肽是荧光蛋白的互补部分。荧光蛋白可包括sfgfp、gfp、egfp、degfp、frgfp、eyfp、ebfp、ecfp、citrine、venus、cerulean、dronpa、dsred、mkate、mcherry、mrfp、fast、smurfp、mirfp670nano。例如，肽标签可以是gfp11，其它多肽可以是gfp1-10。肽标签可以是sfcherry的一个组分。肽标签可以是sfcherry11，其它多肽可以是sfcherry1-10。在存在羟基亚苄基罗丹宁类似物的情况下，肽标签可以是cfast11或cfast10，其它多肽可以是nfast。

18、肽标签可以是ccgfp11和另外的多肽可以是ccgfp1-10。

19、例如，gfp1-10多肽的氨基酸序列可以源自sfgfp：

20、seq id no：1

21、

22、供选择地，gfp1-10多肽氨基酸序列可由上述序列进一步突变，以在互补时更快地变得更亮。该序列可以与本文提到的任何序列具有大于90％的同源性。该序列可以与本文提到的任何序列具有大于95％的同源性。

23、seq id no：2

24、

25、gfp1-10多肽氨基酸序列也可以源自ccgfp，与以下序列具有大于90％或95％的同源性：

26、seq id no：3(ccgfp1-11)

27、

28、seq id no：4(ccgfp1-10)

29、

30、seq id no 5(ccgfp1-10)

31、

32、表达seq id no 5ccgfp1-10的核酸序列；seq id no：6

33、

34、seq id no7

35、

36、

37、表达seq id no 7ccgfp1-10的核酸序列；seq id no：8

38、

39、互补的gfp11肽的氨基酸序列可以是以下：

40、1.krdhmvllefvtaagitgt(seq id no：9)

41、2.krdhmvlhefvtaagitgt(seq id no：10)

42、3.krdhmvlhesvnaagit(seq id no：11)

43、4.rdhmvlheyvnaagit(seq id no：12)

44、5.gdavqiqehavakyftv(seq id no：13)

45、6.gdtvqlqehavakyftv(seq id no：14)

46、7.getiqlqehavakyfte(seq id no：15)

47、或其截短形式。截短可包括从n末端、c末端或其组合缩短多达5个氨基酸。

48、gfp11或gfp1-10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。

49、还公开了用于表达特定标签的核酸序列。核酸序列包括

50、seq id no：16

51、

52、seq id no：17

53、

54、或其截短形式。

55、这些序列可以重复一次或多次，以产生具有多个gfp11结构域的蛋白。

56、例如，sfcherry1-10多肽的氨基酸序列可以是：

57、seq id no：18

58、

59、互补的sfcherry11肽氨基酸序列可以是：

60、seq id no：19

61、ytiveqyeraegrhstgg

62、sfcherry11或sfcherry1-10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。

63、例如，nfast多肽的氨基酸序列可以是：

64、seq is no：20

65、

66、互补的cfast11肽氨基酸序列可以是：

67、seq id no：21

68、gdsywvfvkrv

69、或者互补的cfast10肽氨基酸序列可以是：

70、seq id no：22

71、gdsywvfvkr

72、nfast、cfast11和/或cfast10可以通过氨基酸接头与所关注的蛋白融合。在一个实施方案中，寡肽、肽或多肽接头可以是0-50个氨基酸。

73、肽标签也可以是形成可检测底物，诸如发光或发色底物的蛋白的一个组分。蛋白可包括β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶或荧光素酶。

74、蛋白可与多个标签融合。例如，蛋白可与多个gfp11肽标签融合，并在多个gfp1-10多肽的存在下发生合成。gfp可以是ccgfp或sfgfp。例如，蛋白可以与多个ccgfp11肽标签融合，并在多个ccgfp1-10多肽的存在下发生合成。所关注的蛋白可以与一个或多个sfcherry11肽标签和一个或多个gfp11肽标签融合，并在一个或多个gfp1-10多肽和一个或多个sfcherry1-10多肽的存在下发生合成。

75、任何所关注的蛋白都可以被合成。蛋白可以是酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或其截短形式，或其它物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)的同源氨基酸序列，或任何物种的polμ、polβ、polλ和polθ的同源氨基酸序列，或任何物种的x家族聚合酶的同源氨基酸序列。

76、合成可以在微流体装置，例如电介质上的电润湿(ewod)装置中进行。供选择地，合成可以以微量滴定板形式进行。