本公开总体上涉及微生物宿主细胞、分子生物学、蛋白质工程、发酵、蛋白质生产等领域。本公开的某些方面涉及新型启动子和5′-非翻译区核酸(dna)序列。相关申请的交叉引用本技术要求2022年9月2日提交的美国临时专利申请号63/374,450的优先权，该临时专利申请的公开内容通过援引以其全文并入本文。序列表的引用命名为“nb41861-wo-pct_sequencelisting.xml”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2023年8月30日，并且大小为53kb，其特此通过援引以其全文并入。
背景技术：
1、基因工程促进了用作工业生物反应器或细胞工厂的宿主微生物的各种改进。例如，革兰氏阳性细菌宿主细胞可以生产并分泌大量有用的蛋白质和代谢物。工业中使用的最常见芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)是地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(b.subtilis)。由于其通常认为安全(gras)的状态，芽孢杆菌属物种的菌株是用于生产用于食品和制药工业中的蛋白质的天然候选物。例如，重要的生产酶包括α-淀粉酶、中性蛋白酶、碱性(或丝氨酸)蛋白酶等。然而，尽管对芽孢杆菌属宿主细胞中生产蛋白质的认识有所进步，仍然需要通过微生物改善这些蛋白质的表达/生产的方法及其组合物。
2、由目的基因(或orf)编码的目的蛋白(poi)的重组生产典型地通过构建适用于所需宿主细胞的表达载体来完成，其中编码所需poi的核酸置于启动子的表达控制之下。因此，通过各种技术(例如，经由转化)将表达载体引入宿主细胞，并通过在适于表达和生产蛋白质产物的条件下培养经转化的宿主细胞来实现所需蛋白质产物的生产。例如，已经描述了用于重组表达功能性多肽的芽孢杆菌属物种启动子(及其相关元件)(例如，kim等人,2008和美国专利号4,559,300)。尽管已知许多启动子，但本领域仍然需要可以改善编码目的蛋白的异源核酸的表达的新型启动子(核酸)序列。例如，在工业生物技术领域中，甚至工业相关蛋白(例如，酶、抗体、受体等)的表达/生产水平的相对小幅增加也转化为所生产的重组蛋白的显著成本、能量和时间节省。
技术实现思路
1、如本文总体所述，本公开尤其提供了用于在革兰氏阳性细菌(宿主)细胞中生产目的蛋白的组合物和方法。某些实施例涉及新型启动子和5′-utr核酸(dna)序列，包含新型启动子/5′-utr序列的重组多核苷酸(例如，载体、质粒、表达盒等)，包含可操作地连接到编码蛋白质信号(分泌)序列的dna序列、和/或可操作地连接到编码前区序列的dna序列、可操作地连接到编码目的蛋白的dna序列等的新型启动子/5′-utr序列的重组多核苷酸。
2、因此，本公开的某些实施例提供了包含在seq id no:8至seq id no:46中的任一个中所示的至少一个突变的变体核酸序列，其中这些变体核酸序列的核苷酸位置根据seqid no:1编号。在某些其他实施例中，变体核酸包含seq id no:8至seq id no:46中的任一个的核苷酸序列，其中这些变体序列的核苷酸位置根据seq id no:1编号。在某些其他实施例中，变体核酸序列与seq id no:1具有至少约97.5％同一性。在相关方面，本公开的变体核酸序列可以被称为变体启动子/5′-非翻译区(5-utr)序列。
3、某些其他一个或多个实施例涉及包含本公开的变体核酸序列的多核苷酸(dna)。因此，某些实施例提供了包含本公开的变体核酸序列的多核苷酸，这些变体核酸序列可操作地连接到编码目的蛋白的下游(3′)核酸序列。
4、在某些其他实施例或方面，包含本公开的变体核酸序列的多核苷酸可操作地连接到编码前区序列的下游(3′)核酸序列，该下游(3′)核酸序列可操作地连接到编码成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。在某些其他实施例或方面，包含本公开的变体核酸序列的多核苷酸可操作地连接到编码蛋白质信号(分泌)序列(ss)的下游(3′)核酸序列，该下游(3′)核酸序列可操作地连接到编码成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。在某些其他实施例或方面，包含本公开的变体核酸序列的多核苷酸可操作地连接到编码蛋白质信号(分泌)序列(ss)的下游(3′)核酸序列，该下游(3′)核酸序列可操作地连接到编码前区(pro)序列的下游核酸序列，该下游核酸序列可操作地连接到编码成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。
5、在某些相关实施例中，poi选自由以下组成的组：酶、抗体、受体蛋白、凝集素和调节蛋白。
6、其他实施例提供了包含本公开的多核苷酸的表达盒。在相关实施例中，革兰氏阳性细菌(宿主)细胞包含本公开的一个或多个引入的盒。在某些实施例中，革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属物种细胞。在相关实施例中，芽孢杆菌属物种(宿主)细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(b.lentus)、短芽孢杆菌(b.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、灿烂芽孢杆菌(b.lautus)、和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)。
7、本公开的某些其他实施例提供了用于在革兰氏阳性细菌细胞中生产目的蛋白(poi)的方法，这些方法包括(a)向革兰氏阳性细胞中引入表达盒，该表达盒包含seq idno:8至seq id no:46中的任一个的变体核酸序列，该变体核酸序列可操作地连接到编码目的蛋白(poi)的下游(3′)核酸序列；和(b)在适用于生产该poi的条件下培养该经修饰的细胞。在这些方法的某些优选实施例中，相对于(相比于)包含引入的表达盒的对照革兰氏阳性细胞，经修饰的细胞生产增加量的poi，该引入的表达盒包含可操作地连接到编码相同poi的下游(3′)核酸序列的seq id no:1的参考核酸序列，其中在相同条件下培养经修饰的细胞和对照细胞。在这些方法的某些其他实施例中，在培养至少约七十二(72)小时之后，相对于对照细胞，经修饰的细胞生产增加量的poi。在这些方法的又其他实施例中，目的蛋白(poi)选自由以下组成的组：酶、抗体、受体蛋白、凝集素和调节蛋白。在这些方法的某些实施例中，酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂合酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。在这些方法的某些其他实施例中，革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属物种细胞。