一种烟草烟碱转化率鉴定方法

本发明涉及烟草种植，具体涉及一种烟草烟碱转化率鉴定方法。

背景技术：

1、烟碱和降烟碱是烟草中的主要生物碱成分，在大部分的烟草品种中，烟碱占总生物碱的90％～95％，降烟碱占2％～3％，有些品种或群体由于不稳定转化基因位点被激活而具备了烟碱去甲基化的能力，导致烟碱大量被转化为降烟碱，降烟碱含量可达总生物碱的68％。烟碱转化烤烟材料正常调制后，叶片正面颜色丹红或硃红，也有称“樱桃红”，叶片香气品质独特，是开发中式卷烟高端品牌的最佳优质烟叶原料，具有较强的开发应用价值。

2、烟碱转化为降烟碱的过程由烟碱去甲基酶控制，普通烟草中有4个烟碱去甲基酶基因，其中cyp82e5、cyp82e10和cyp82e21分别在烟草绿色未衰老叶片、根部和花中表达，与“转化株”的高降烟碱无明显贡献。cyp82e4受衰老诱导表达，在绿色未衰老的叶片中表达量很低或者不表达，当叶片衰老后表达量急剧升高，降烟碱含量和烟碱转化率大幅上升，是导致烟碱转化的关键基因。

3、“转化株”筛选的常规方法是在烟株大田移栽后40～50d，将叶片经过乙烯利、碳酸氢钠等化学物质的处理促进衰老，再测定烟碱和降烟碱的含量，计算转化率。根据大田成熟叶片中烟碱去甲基酶基因(cyp82e4)与烟碱转化率之间的线性关系，利用qrt-pcr方法建立了基于cyp82e4表达量的“转化株”鉴定方法，在分子水平上鉴定“转化株”烟草。为了快速鉴别烟草群体中的烟碱转化株，通过直接测定烟草幼苗期非衰老叶片或经过高温衰老处理后衰老叶片降烟碱含量，开发了幼苗期“转化株”筛选方法，这种方法可以方便、快速、简单的识别幼苗群体中烟碱转化株。但烟碱转化为数量性状，受主基因和多基因控制，环境条件及衰老程度对转化率影响极大，不适宜的条件尤其是衰老程度，烟碱转化率差异很大，“转化株”的表型不能正常表现。因此，需要开发一种新的方法，即能在烟草幼苗期快速高效进行，又能保证烟碱转化率鉴定的准确性。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供一种烟草烟碱转化率鉴定方法。对32个在烟碱转化率上有分离的bc4f2代单株在苗期进行cyp82e4定量表达检测，并在烟叶成熟期测定每个单株的烟碱转化率，相关性分析显示苗期cyp82e4表达水平与成熟后的烟碱转化率呈显著正相关，相关系数为0.853。本发明为批量精确鉴定烟草群体中烟碱转化株提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种烟草烟碱转化率鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

4、(一)建立苗期烟草离体叶片衰老处理后cyp82e4表达量与烟草成熟后烟碱转化率间的相关关系：

5、以“非转化”烟草和“转化”烟草为亲本构建在烟碱转化率上有性状分离的单株群体；

6、取以上单株群体苗期烟草叶片，用次氯酸钠溶液浸泡后，用水洗去表面残余溶液并吸干水分，均匀喷施乙烯利后黑暗处理，对烟草离体叶片进行衰老处理；

7、提取衰老处理后烟草叶片rna，利用qrt-pcr法对烟碱去甲基酶基因cyp82e4进行荧光定量分析，采用2-△△ct法测定基因相对表达量；

8、将烟株移栽至大田，待中部烟叶成熟后测定降烟碱和烟碱含量，并计算烟碱转化率；

9、建立苗期烟草离体叶片衰老处理后cyp82e4表达量与烟草成熟后烟碱转化率间的相关关系；

10、(二)待测烟草烟碱转化率鉴定

11、收集待测烟草苗期烟草叶片，按以上步骤(一)所述方法对烟草离体叶片进行衰老处理并测定cyp82e4基因相对表达量，根据步骤(一)建立的相关关系对待测烟草烟碱转化率进行鉴定。

12、进一步地，喷施200-300mg/l乙烯利后黑暗处理4～8天。

13、进一步地，所述苗期烟草叶片为假植后15-25天的烟草叶片。

14、与现有技术相比，本发明具有以下优势：

15、本发明以cyp82e4的相对表达量为指标，建立了苗期评估烟碱转化率的评价方法。与现有方法相比，本发明方法一是鉴定结果稳定精确，可用于烟碱转化遗传群体的表型鉴定，本发明方法不但能对差异较大的实验材料实现定性鉴定，还可以对转化水平差异不大的材料实现定量检测，这是以往的鉴定方法不能实现的；二是鉴定时期更早，由于是对烟碱去甲基酶基因分子水平的表达检测，需要的材料起始量很少，可以在假植后20天进行鉴定，本发明为批量精确鉴定烟草群体中烟碱转化株提供技术支持。

技术特征：

1.一种烟草烟碱转化率鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，喷施200-300mg/l乙烯利后黑暗处理4～8天。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述苗期烟草叶片为假植后15-25天的烟草叶片。

技术总结
本发明涉及烟草种植技术领域，具体涉及一种烟草烟碱转化率鉴定方法。本发明发现苗期CYP82E4表达水平与成熟后的烟碱转化率呈显著正相关，本发明所述方法以CYP82E4的相对表达量为指标，建立了苗期评估烟碱转化率的评价方法。与现有方法相比，本发明方法鉴定结果更为稳定精确，同时鉴定时期更早，需要材料起始量很少，本发明为批量精确鉴定烟草群体中烟碱转化株提供技术支持。

技术研发人员：李凤霞,宋时洋,杨爱国,王雅琦,望锦
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25