一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒的制作方法

本发明涉及基因诊断领域，具体为一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒。

背景技术：

1、据世界卫生组织国际癌症研究机构(who iarc)发布的2020年最新全球癌症负担数据显示：2020年全球胃癌新发病例数108.9万，死亡病例数76.8万。

2、造成胃癌死亡率高、治愈率低的一个重要因素是早期胃癌的确诊率较低。绝大多数胃癌早期无明显症状，或仅仅出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，大部分患者发现时已为进展期，预后差。临床研究发现，从胃癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要数年时间，这为发现早期胃癌、提高早期胃癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高胃癌治疗效果、降低胃癌死亡率。

3、目前胃癌的筛查手段主要有ｘ线钡剂检查、内镜检查和血清学筛查，最终确诊需要病理证实。 然而，这些技术要么检测灵敏性低，如血清肿瘤标志在进展期胃癌中的阳性率仅为20%~30%，在早期胃癌中的阳性率于10%；要么侵入性强，部分人群排斥，如胃镜；要么检测成本较高，不适用于大面积的筛查，如磁控胶囊内镜。在胃癌的检测和诊断的使用受到限制，无法充分满足临床检测的需求。近几年兴起的肿瘤生物标识物(如：胃蛋白酶原)检测技术具有方便、快捷、灵敏、无创等技术优势，便于临床使用和推广，然而，单一肿瘤标识物难以实现理想的肿瘤检测性能。

4、基于此，当前对能够有效提高胃癌的检测效果的检测技术存在需求。因此，开发灵敏、特异的新型胃癌生物标识物和检测技术是提高胃癌检出率、改善胃癌治疗效果、降低胃癌死亡率的重要途径。ctdna甲基化是较为理想的检测标志物。研究表明，抑癌基因甲基化水平升高的现象通常发生在癌症初期，是肿瘤早期发展的标志性改变；而在人类基因组cpg岛中，60-80％的胞嘧啶残基被甲基化修饰，dna甲基化已成为癌症发生发展过程中丰富的信号来源，dna甲基化几乎在所有的肿瘤中都有发生，使其成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。因此，特定基因区域甲基化状态可以作为特定肿瘤检测的标志性事件。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒，本发明提出的用于检测基因sept9和elmo1特定区域中至少一个区域内多个cpg的甲基化状态，在血浆样本中实现胃癌的较高特性和灵敏度的检测，在组织样本中，可以显著区分癌组织和正常组织（癌旁组织）。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于胃癌检测的引物探针组合物，包括特异性检测基因sept9甲基化区域的引物和荧光探针、特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物和荧光探针、内参基因col2a1的特异性引物和探针；

4、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的引物序列为：

5、sept9-f：agttggaaatgattttatttagttg(seq id no:1）；

6、sept9-r：ccaccaaccatcatatc(seq id no:2）；

7、所述特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物序列为：

8、elmo1-f：tttggggtcgtaggatagtagc(seq id no:3）；

9、elmo1-r：caattccccttcaataataacga(seq id no:4）；

10、所述内参基因col2a1的特异性引物序列为：

11、col2a1-f：gtaatgttaggagtattttgtgggta(seq id no:5）；

12、col2a1-r：ctagcccaaaaaaacccaatccta(seq id no:6）；

13、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的荧光探针序列为：

14、sept9-p：aaccccgcgatcaacg(seq id no:7）；

15、探针的5’端标记有荧光报告基团vic，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

16、特异性检测基因elmo1甲基化区域的荧光探针序列为：

17、elmo1-p：agggttttcggcgattagagtttcg(seq id no:8）；

18、探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

19、内参基因col2a1的特异性探针序列为：

20、col2a1-p：agaagaagggaggggtgttaggagagg(seq id no:9）；

21、探针的5’端标记有荧光报告基团cy5，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2。

22、作为本发明进一步的方案，所检测的基因sept9和elmo1特定区域序列含有多个cpg二核苷酸结构，并且cpg二核苷酸结构的c碱基存在甲基化基团修饰。

23、作为本发明进一步的方案，还包括特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针以及特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针；

24、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针序列为：

25、sept9-b：ttagttgtgtgttgattgtgggg(seq id no:10）；

26、所述特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针序列为：

27、elmo1-b：caataataacaaatcaccaaaactctaatcaccaaaa(seq id no:11）。

28、一种用于胃癌检测的试剂盒，包括本发明中提到的引物探针组合物、核酸提取试剂、核酸转化试剂pcr mix、阳性对照和阴性对照中的至少一种。

29、本发明具有以下有益效果：

30、本发明的引物探针组合物用于扩增基因sept9和elmo1特定的cpg位点富集区域。利用本发明的方法，特定的cpg位点富集区域高甲基化状态时可被特异性扩增，低或无甲基化状态时则无法扩增。本发明的试剂盒包括基因sept9和elmo1甲基化引物和探针，还包括内参基因col2a1的引物和探针。

31、通过本发明试剂盒可同时检测基因sept9和elmo1甲基化状态，基因sept9和elmo1甲基化状态可作为胃癌标记物，实现胃癌的检测。

32、本发明采用多重荧光定量pcr检测方法，特异性和灵敏度较高、重复性好，操作简单，能帮助临床医生更加精准评估胃癌病变风险，提高胃癌检出率，从而降低胃癌死亡率。

33、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。

技术特征：

1.一种用于胃癌检测的引物探针组合物，其特征在于，包括特异性检测基因sept9甲基化区域的引物和荧光探针、特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物和荧光探针、内参基因col2a1的特异性引物和探针；

2.如权利要求1所述的一种用于胃癌检测的引物探针组合物，其特征在于，所检测的基因sept9和elmo1特定区域序列含有多个cpg二核苷酸结构，并且cpg二核苷酸结构的c碱基存在甲基化基团修饰。

3.如权利要求2所述的一种用于胃癌检测的引物探针组合物，其特征在于，还包括特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针以及特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针；

4.一种用于胃癌检测的试剂盒，其特征在于，其引物探针组合物如权利要求1-3任一所述的引物探针组合物。

5.如权利要求4所述的一种用于胃癌检测的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂pcr mix、阳性对照和阴性对照中的至少一种。

技术总结
本发明公开了一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒，本发明的试剂盒包括所述基因SEPT9和ELMO1甲基化引物和探针，还包括内参基因COL2A1的引物和探针。通过本试剂盒可同时检测基因SEPT9和ELMO1甲基化状态，基因SEPT9和ELMO1甲基化状态可作为胃癌标记物，实现胃癌的检测。本发明采用多重荧光定量PCR检测方法，特异性和灵敏度较高、重复性好，操作简单，能帮助临床医生更加精准评估胃癌病变风险，提高胃癌检出率，从而降低胃癌死亡率。

技术研发人员：潘小宝,王慧勇,王林
受保护的技术使用者：慧算医疗科技（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27