一种猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶的抗原表位、抗体的制备及应用

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种prrsv解旋酶的抗原表位、单克隆抗体制备方法及应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs virus，prrsv)引起的接触性传染病，主要症状为妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道疾病。1996年，我国首次分离prrsv。目前在临床上，多种来源的毒株混合流行，且可能发生毒株之间的重组，以及与其他病毒性和细菌性病原的混合继发感染。鉴于该病毒复杂严峻的流行态势，制备病毒编码的与复制转录相关的重要蛋白的单克隆抗体，将为开展prrsv基础及应用研究提供重要的试验工具。

2、解旋酶(helicase，nsp10)进化上相对保守，是prrsv复制-转录复合物(rtc)的重要组成部分，在所有核酸参与的细胞进程中发挥重要作用，对病毒rna合成至关重要，使得nsp10成为药物开发的重要靶标。prrsv解旋酶属于sf1超家族中的upf1-like家族解旋酶，可以解旋双链dna和双链rna，方向为5′→3′，并具有atp酶活性。upf1-like家族解旋酶都具有两个非常保守的结构域：n-末端的半胱氨酸-祖氨酸富集结构域(锌指结构域、zbd)、1b结构域、c-末端结构域(ctd)。ctd含有两个reca-like折叠，即1a和2a亚结构域，构成解旋酶核心。prrsv解旋酶具有保守的结构域，同时其关键结构域也具有独特的空间构象。

3、解旋酶在prrsv感染和致病过程中起着至关重要的作用：第一、可以发挥自身解旋酶活性，在病毒转录和复制过程中打开特定的rna结构，直接促进病毒基因组rna的合成；第二、可以通过自身关键氨基酸结构域和关键氨基酸位点的突变，引导病毒复制效率和毒力的变异，调节病毒致病、传播能力、免疫逃逸等重要生物学表型，利于自身流行和传播；第三、可以参与调控宿主免疫应答，诱导重要免疫分子激活，参与免疫抑制形成和巨噬细胞极化表型转变，促进自身感染。另外，作为最保守的病毒非结构蛋白之一，prrsv解旋酶可以作为一种很好的诊断标志物候选分子。

4、本发明利用细胞融合以及亚克隆筛选，成功获得了一株针对prrsv解旋酶nsp10的单克隆抗体，并对其抗原表位进行了鉴定，发现其能够识别nsp10的425－434肽段，其氨基酸序列为(425tdkrvvdslr434)。利用软件分析发现该抗原表位在prrsv-2中非常保守。该单克隆抗体具有很强的特异性，可以鉴别诊断不同基因型的prrsv，为将来prrsv的基础和应用研究提供了很有价值的工具。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种prrsv解旋酶的单克隆抗体及其制备方法与应用。本法的技术方案是：通过将prrsv nsp10基因克隆到pcold-i表达载体中构建原核表达载体，利用不同浓度咪唑洗脱的方式纯化蛋白，将纯化后的nsp10作为抗原免疫balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，用纯化的nsp10包被板子，通过间接elisa筛选能够特异性识nsp10的阳性杂交瘤细胞。

2、具体发明有：获得了1株可特异性识别prrsv nsp10的单克隆抗体。可用于ifa、western blotting检测，能够很好地识别nsp10，亚型鉴定表明该单克隆抗体重链为igg1，轻链为kappa链。通过构建截短表达的nsp10以及合成一系列nsp10短肽，最终确定了该单克隆抗体能特异性识别prrsv nsp10的425－434肽段，其氨基酸序列为425tdkrvvdslr434，如seq id no.1所示。

技术特征：

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)解旋酶nsp10的抗原表位，所述抗原表位可以特异性识别prrsvnsp10。

2.如权利要求1所述的一种prrsv nsp10的抗原表位，所述抗原表位为prrsv nsp10的425－434肽段，其氨基酸序列为(425tdkrvvdslr434)，在基因2型prrsv中保守，可用于ifa实验中nsp10和western blotting实验中还原状态下nsp10的检测。

3.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的prrsv nsp10的抗原表位的抗体，所述抗体是单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。

4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的鉴别诊断或检测基因2型prrsv。

5.一种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1或2中所述的抗原表位给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含在所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。

6.权利要求1或2所述的一种prrsv nsp10的抗原表位、权利要求3所述的抗体制剂、权利要求4所述的抗体制剂在鉴别诊断或检测基因2型prrsv中的应用。

技术总结
本发明涉及一株针对PRRSV解旋酶的抗原表位、单克隆抗体制备方法及应用。通过构建原核表达载体pCold‑I‑Nsp10，利用大肠杆菌表达重组Nsp10，纯化后免疫Balb/c小鼠，经过四次免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞，然后利用间接ELISA方法进行亚克隆获得抗PRRSV Nsp10的单克隆抗体，并鉴定了该抗体所对应的抗原表位为<supgt;425</supgt;TDKRVVDSLR<supgt;434</supgt;。

技术研发人员：李丽薇,高飞,段宏勇,姜一峰,童武,周艳君,童光志,王树茂,韩松
受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22