一种检测三个植物蛋白形成复合物的TriFC试验系统及其应用

本发明涉及多个荧光分子蛋白互作以及复合体形成的验证，具体涉及一种检测三个植物蛋白形成复合物的trifc试验系统及其应用。

背景技术：

1、蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，对于蛋白复合物的鉴定是一种重要的生物学研究方法，可以帮助我们了解蛋白质在细胞内的相互作用与功能。蛋白质复合物是由两个或多个蛋白质相互作用形成的复合物，它们在细胞中发挥着重要的生物学功能，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。

2、目前，研究蛋白质-蛋白质相互作用常用方法主要包括，酵母双杂交技术(yeasttwo-hybrid，y2h)、双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation，bifc)、免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation，co-ip)及荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer，fret)等，以及近几年来逐步应用到的萤火虫荧光素酶互补技术(firefly luciferase complementation)，但是目前这些技术都是对两个蛋白质之间的互作进行验证。多蛋白复合体通过蛋白质间的相互作用调控了许多细胞生命过程，很多信号蛋白往往以蛋白复合体的形式发挥功能。最近发展的三个发射团所依赖的荧光共振能量转移(3-fret)和双分子荧光互补依赖的荧光共振能量转移(bifc-fret)技术被用于研究三个蛋白质间的相互作用。但是这些方法往往依赖精端的荧光成像设备，高难度的实验操作步骤以及复杂的数据处理过程，同时在荧光共振能量转移过程中的光谱串色也容易混淆实验结果，因此发展一种简便、可行的研究三个蛋白质相互作用的方法显的尤为重要。

3、目前酵母三杂交验证蛋白复合体形成一定的局限性，具体表现为如果a与b蛋白不互作，加入第三个蛋白c后酵母三杂交可以正常酵母生长，那么能说明a/b/c蛋白能形成复合物。相反，如果蛋白a与b互作，那么酵母三杂交系统只能用于验证蛋白c竞争性结合抑制蛋白a与b的互作，不能用于证明a/b/c三者蛋白是否形成复合物。因此用酵母三杂交系统验证三个蛋白形成复合物存在一定的局限性。

技术实现思路

1、为解决上述存在的技术缺陷，本发明提供了一种新的试验系统来验证三个蛋白互作形成复合体，为验证三个相互作用的蛋白的关系提供了一种新的试验思路。该新系统基于在同一细胞内共表达分别与mvenus的拆分片段vn154、vn(156-172)和vc173相融合表达的蛋白，通过检测细胞内mvenus的重构荧光，就可以成像多蛋白的相互作用。该系统为一种灵敏、有效、可靠的用于细胞内多蛋白相互作用成像的荧光片段互补系统。将该试验系统命名为trifc(trimolecular fluorescence complementation)。

2、本发明的第一方面，提供一种检测三个植物蛋白形成复合物的trifc试验系统，包括：

3、1)表达盒甲，其由串联的vn154与第一目的基因cds表达第一融合蛋白；

4、2)表达盒乙，其由串联的第二目的基因cds序列和vn156-173表达第二融合蛋白；

5、3)表达盒丙，其由串联的第三目的基因cds序列和vn174表达第三融合蛋白；

6、所述vn154、vn156-173和vn174的序列依次如seq id no.1～3所示。

7、本发明以gfp来源的荧光蛋白mvenus序列为基础，选取合适的拆分位点，在氨基酸154与156位以及173与174位之间将mvenus拆分为三段，分别表达出三个不发荧光的蛋白片段vn154，vn(156-173)和vn174，当这三个片段分别与三个相互作用的蛋白相融合并共表达在同一个细胞内，三个不发荧光的蛋白片段vn154，vn(156-173)和vn174就可以被相互作用的蛋白拉近，重新恢复为荧光蛋白mvenus的完整构象而激发产生荧光信号，而且，当以氨基酸155位进行拆分获得的vn155会有自发荧光(如图4所示)，如此便无法确定与vn155串联的目的基因是否与另外两个目的基因是否相互作用。

8、作为本发明所述trifc试验系统的优选，还包括表达番茄丛矮病毒p19蛋白的表达盒丁，用于抑制宿主对外源基因的rna沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达。

9、本发明的第二方面，提供一种重组表达载体，包含所述的trifc试验系统。

10、进一步的，所述表达盒甲、表达盒乙、表达盒丙和表达盒丁分开构建于不同载体中。

11、本发明的第三方面，提供所述重组表达载体在检测蛋白互作以及复合物形成中的应用。

12、本发明的第四方面，提供一种检测三个植物蛋白互作以及复合物形成的方法，包括如下步骤：

13、将所述重组表达载体导入目标植物，然后检测mvenus荧光信号的表达，若有荧光信号，则三个植物蛋白之间存在互作关系，且形成复合物。

14、进一步的，检测mvenus荧光信号时选取荧光波长514nm的yfp荧光通路拍照检测荧光的情况。

15、进一步的，所述目标植物包括烟草、葡萄和苹果。

16、更进一步的，当目标植物为烟草时，导入采用注射法。

17、更进一步的，当目标植物为葡萄或苹果时，导入采用真空渗入法。

18、进一步的，所述植物包括烟草、葡萄和苹果。

19、与现有技术相比，本试验系统的有益效果在于：

20、1、本试验系统可以验证三个蛋白之间形成复合体，在本氏烟草，葡萄组培苗叶片，苹果组培苗叶片中都可以明显表达。在短时间内可以验证三个蛋白之间的关系，且不受时间限制，周期较短。

21、2、目前三个蛋白复合物研究的方法包括三个发射团所依赖的荧光共振能量转移(3-fret)和双分子荧光互补依赖的荧光共振能量转移(bifc-fret)技术。这些方法不仅依赖精端的荧光成像设备以及高难度的实验技术，同时在荧光共振能量转移过程中的光谱串色也容易混淆实验结果。而酵母三杂交验证蛋白复合体形成一定的局限性。本发明的trifc系统为一种简单、有效、可靠的研究多蛋白相互作用的系统。

22、3、三片段荧光互补系统能够特异性的检测到弱的瞬间相互作用，是一种检测多蛋白相互作用的简便、直观、灵敏的方法。

技术特征：

1.一种检测三个植物蛋白形成复合物的trifc试验系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的trifc试验系统，其特征在于，还包括表达番茄丛矮病毒p19蛋白的表达盒丁。

3.重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的trifc试验系统。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达盒甲、表达盒乙、表达盒丙和表达盒丁分开构建于不同载体中。

5.权利要求4所述重组表达载体在检测蛋白互作以及复合物形成中的应用。

6.一种检测三个植物蛋白互作以及复合物形成的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，检测mvenus荧光信号时选取荧光波长514nm的yfp荧光通路拍照检测荧光的情况。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标植物包括烟草、葡萄和苹果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当目标植物为烟草时，导入采用注射法。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当目标植物为葡萄或苹果时，导入采用真空渗入法。

技术总结
本发明涉及多个荧光分子蛋白互作以及复合体形成的验证技术领域，具体涉及一种检测三个植物蛋白形成复合物的TriFC试验系统及其应用。所述TriFC试验系统，包括：1)表达盒甲，其由串联的VN154与第一目的基因CDS表达第一融合蛋白；2)表达盒乙，其由串联的第二目的基因CDS序列和VN156‑173表达第二融合蛋白；3)表达盒丙，其由串联的第三目的基因CDS序列和VN174表达第三融合蛋白；所述VN154、VN156‑173和VN174的序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。相比于酵母三杂交验证蛋白复合体，本发明的TriFC试验系统可以在植物体内更简便、直观、灵敏的检测多蛋白相互作用。

技术研发人员：许腾飞,刘贵鹏,边璐,梁雅婷,张亮,赵文,王琪琪,于新册,徐倩,付佳豪,孟江飞
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17