一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、生物膜是指微生物为了适应环境，黏附于非生物或活性组织表面，分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等不均一的胞外基质，将菌体自身包裹在其中而形成的大量菌体聚集膜状物。生物膜的大部分生物量由水和细胞外聚合物(eps)组成，而不是微生物细胞。eps基质主要由多糖、蛋白质、脂质和细胞外dna组成，它介导了生物膜结构的形成，这是一个连续的、动态的过程。

2、生物膜的研究一直是微生物领域的热点问题，在自然、工业、医药等领域发挥重要作用。生物膜的生物技术应用包括水的过滤，废水和固体废物的降解，生物技术过程中的生物催化，以及生物燃料等。在生物膜介导的化学品合成中，生物膜介导的生物过程可以通过增强生物膜形成来改善，控制生物膜维持在一个最佳的厚度范围内是实现稳健生物膜高效作用的关键。

3、细胞信号传递是细胞与外部环境的交流方式，是生物体内分子信号传递的基本过程。信号分子通过与膜蛋白的结合，激活细胞内信号通路，引发下游的分子反应，从而触发一系列生理响应。而生物膜作为细胞内外分子交换的中介，无论是化学信号还是电信号，它在细胞信号传递和调节中起着至关重要的作用。

4、在微生物电化学系统中，电活性微生物粘结依附于电极表面通过分泌的胞外聚合物相互粘结交互形成电活性生物膜，是系统中普遍存在的群体作用形式。生物膜的形成能够实现有效的细胞间隙。在此基础上，微生物和电极界面上的电子传递是影响微生物电化学系统的关键限速步骤。

5、因此，本发明希望筛选对生物膜形成有影响的基因，获得能够促进生物膜形成的菌株，以此来提高生物膜的成膜效率和改善生物膜的性能，强化大肠杆菌和电极界面电子传递，进而提高mfc输出电压。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。

3、本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组大肠杆菌在促进生物膜形成、提高电子传递效率中的应用。

4、本发明的思路是：通过在单敲菌库keio collection(宿主bw25113，采购自日本)中挑选对生物膜形成影响的5大功能分组(c-di-gmp磷酸二酯酶、二鸟苷酸环化酶、群体感应、细胞结构及鞭毛、其他调节因子)19个基因的单敲除菌株，利用结晶紫染色法筛选得到敲除后促进大肠杆菌生物膜增长的基因。然后通过crispr-cas9系统构建单敲除生物膜形成基因的重组大肠杆菌。再利用结晶紫染色法、胞外多糖测定法、蛋白浓度测定法复筛，最终得到一株能够有效促进生物膜形成的重组大肠杆菌，并使用微生物电化学装置检测敲除相应生物膜形成基因对mfc输出电压的影响。

5、为了解决上述技术问题，本发明的方案如下：

6、一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，通过单敲除生物膜形成基因得到的；

7、其中，所述的生物膜形成基因为yhjh、yjcc、yoad、lsrk、lsrr基因中的任意一种。

8、优选的，所述的生物膜形成基因为yhjh、yjcc、lsrk基因中的任意一种。

9、更优选的，所述的生物膜形成基因为yhjh基因。

10、其中，所述的yhjh、yjcc、lsrk基因，其核苷酸序列依次如seq id no.1～3所示。

11、其中，所述的大肠杆菌为e.coli bl21、e.coli bl21(de3)、e.coli mg1655、e.coli k12、或e.coli k12(δldh，δpfl，δptsg)中的任意一种。

12、优选的，所述的大肠杆菌为e.coli k12(δldh，δpfl，δptsg)，即实施例中所写的大肠杆菌ba102，其详细的信息已经公开在专利cn110628689b和专利cn115786224a中。

13、具体的，上述大肠杆菌e.coli k12(δldh，δpfl，δptsg)；保藏编号为：cctccno：m2018743，已于2018年11月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

14、上述重组大肠杆菌的构建方法也在本发明所保护的范围之内，具体包括如下步骤：

15、(1)根据宿主大肠杆菌的基因组序列，在待敲除生物膜形成基因的上下游各设置500-700bp的同源臂；以上游同源臂、下游同源臂为模板，通过overlap pcr得到基因敲除片段；

16、(2)以载体质粒ptargetf-c为模板，通过pcr扩增替换生物膜形成基因的n20序列，得到替换后的重组质粒；

17、(3)将步骤(1)得到的基因敲除片段和步骤(2)得到的重组质粒转化至大肠杆菌感受态中，即可得到敲除生物膜形成基因的重组大肠杆菌。

18、其中，步骤(2)中，所述的载体质粒ptargetf-c是将购买的商业化ptargef由k抗性替换为c抗性得到的，由实验室保存敲除yhjh基因菌株。

19、其中，步骤(3)中，所述的大肠杆菌含有cas9质粒。

20、其中，步骤(3)中，所述的重组大肠杆菌为ba102-δyhjh、ba102-δyjcc、ba102-δlsrk中的任意一种。

21、优选的，所述的重组大肠杆菌为ba102-δyhjh。

22、上述重组大肠杆菌在促进生物膜形成、提高电子传递效率中的应用也在本发明所保护的范围之内。

23、在本发明的一些实施例中，通过微生物电化学装置测定敲除相应生物膜形成基因对mfc输出电压的影响。结果发现，单敲除yhjh基因菌株在第一轮mfc中后期，其电压比未敲除菌株高。在第二轮mfc中，敲除yhjh基因菌株保持输出电压200mv以上时间比未敲除菌株长。

24、有益效果：

25、(1)本发明通过大肠杆菌生物膜相关的5大功能分组(c-di-gmp磷酸二酯酶、二鸟苷酸环化酶、群体感应、细胞结构及鞭毛、其他调节因子)中的19种基因进行筛选，得到了3种影响较大的生物膜基因：yhjh、yjcc、lsrk基因，并利用crispr-cas9系统构建了相应的单敲除yhjh、yjcc、lsrk基因重组大肠杆菌。

26、(2)本发明通过对单敲除yhjh、yjcc、lsrk基因重组大肠杆菌进行进一步的复筛，得到了一株显著促进大肠杆菌生物膜形成的重组大肠杆菌ba102-δyhjh，提高了大肠杆菌的成膜效率，强化了电子从微生物和电极界面到跨细胞膜进入大肠杆菌细胞内的传递，提高了大肠杆菌的电子传递效率，从而提高了重组大肠杆菌的产电能力。

技术特征：

1.一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，通过单敲除生物膜形成基因得到的；

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的生物膜形成基因为yhjh、yjcc、lsrk基因中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的生物膜形成基因为yhjh基因。

4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的yhjh、yjcc、lsrk基因，其核苷酸序列依次如seq id no.1～3所示。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为e.colibl21、e.coli bl21(de3)、e.coli mg1655、e.coli k12、或e.coli k12(δldh，δpfl，δptsg)中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为e.coli k12(δldh，δpfl，δptsg)。

7.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的大肠杆菌含有pcas9质粒。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的重组大肠杆菌为ba102-δyhjh、ba102-δyjcc、ba102-δlsrk中的任意一种。

10.权利要求1-6任意一项所述的重组大肠杆菌在促进生物膜形成、提高电子传递效率中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株促进生物膜形成的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明利用结晶紫染色法对大肠杆菌生物膜相关的19种基因进行筛选，得到了3种影响较大的生物膜基因：yhjH、yjcC、lsrK基因，并利用CRISPR‑Cas9系统构建了相应的单敲除yhjH、yjcC、lsrK基因重组大肠杆菌。进一步的，通过对上述重组大肠杆菌进行复筛，最终得到了一株显著促进大肠杆菌生物膜形成的重组大肠杆菌BA102‑ΔyhjH，提高了生物膜的成膜效率，改善了生物膜的性能，强化了大肠杆菌和电极界面电子传递，进而提高了MFC输出电压。

技术研发人员：冯娇,杨雯晶,陈可泉,王唯羽,姜志美,虞璟,王昕,许晟
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17