谷氨酸棒杆菌诱导型CRISPR-Cpf1基因组整合系统、构建方法及应用

本发明属于基因工程，具体涉及谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统、构建方法及应用。

背景技术：

1、谷氨酸棒杆菌作为一种新型的底盘菌株和异源蛋白表达宿主，可用于生产氨基酸、化学品、保健品等食品医药产品。传统的菌株改良采用随机诱变的方式，在菌种发育过程中会产生生长缺陷、低耐受性或积累副产物等问题。目前需求量的逐年扩大，用传统发酵生产方式已不能满足市场需求。随着分子生物学和基因组测序技术的发展，利用基因编辑技术对菌株基因组的特定基因进行定向修饰，可提高菌株代谢目的产物的产量。目前，c.glutamicum主要依靠传统的基因编辑方法pk18mobsacb系统，该系统基于卡那霉素抗性基因和果聚糖蔗糖酶编码基因sacb为筛选标记，通过两次同源重组实现基因组上目的基因的无痕编辑，常用于基因敲除，基因整合和定点突变。然而，在实际应用中存在以下问题：首先，sacb因其作用原理，会出现sacb基因失活的现象，产生致死效果差和回复突变率高的问题，降低第二轮筛选效率；其次，当敲除一些影响生长的基因时，第二轮交换后几乎全部回复到原菌，极难筛选到目的菌株；再次，基因组多拷贝整合时，不能精准的选择靶位点。从而产生筛选转化子耗时，效率低，操作复杂的缺点。因此，缩短菌株改造时间，提高重组菌株筛选效率是亟待解决的问题。

2、近几年有关谷氨酸棒杆菌的crispr编辑技术被相继报道，现有理念是在cpf1或cas9蛋白用于切割染色体的同时，实现供体dna分子的同源重组，基因敲除效率低，难以完成大片段基因整合。目前研究报道的谷氨酸棒杆菌crispr-cpf1系统主要设计为all-in-one单质粒模式，也就是把cpf1蛋白、crrna表达框及dna修复片段都在同一个质粒中表达，该研究构建的单质粒系统的编辑效率是5～15％。其次，all-in-one单质粒系统(cpf1、sgrna和同源序列表达在同一载体)存在质粒大小限制问题，很难再表达重组酶系统，会在一定程度上影响系统的编辑效率。由于谷氨酸棒杆菌crispr技术开发不够深入，虽然缩短了操作流程，但正确编辑效率并不高，尤其不适用于大片段基因组整合。

技术实现思路

1、为了提高谷氨酸棒杆菌基因组整合效率，加快其代谢途径改造进程，本发明利用诱导型启动子prpr-prpd2表达cpf1蛋白，构建一个重组质粒含有靶向crrna和靶基因的同源修复模板，另一个质粒诱导表达cpf1蛋白的双质粒系统。该系统将重组和切割事件分离，解决了谷氨酸棒杆菌基因组进行大片段dna整合难题，同时提高了基因编缉效率，为谷氨酸棒杆菌代谢工程研究和菌株构建提供技术保障。

2、为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

3、第一方面，谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统的构建方法，包括以下步骤：

4、(1)构建整合模式菌s-1：在谷氨酸棒杆菌野生菌的cgl1890位点整合一个不完整的kanr基因，构建整合模式菌wt△cgl1890::kans，即整合模式菌s-1；

5、(2)建立prpr-prpd2介导的诱导型crispr-cpf1双质粒基因整合系统：分别构建pec-prpr-prpd2-cpf1和pxmj19-crrnaxyla::kan-xyla500质粒；将ec-prpr-prpd2-cpf1质粒转化至谷氨酸棒杆菌感受态细胞、培养、制备感受态细胞；再将pxmj19-crrnaxyla::kan-xyla500质粒转入所述感受态细胞，涂布cmr-sper培养基平板，32℃过夜培养；将平板的单菌落对点至含有cmr-sper-丙酸钠的培养基平板中，诱导cpf1的表达；再利用pcr进行菌体克隆，获得目的菌株。

6、第二方面，采用上述方法构建的谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统。

7、第三方面，上述谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统在构建l-丝氨酸重组菌株方面的应用。

8、有益效果：(1)本发明设计的整合模式菌(s-1)利用严谨的卡那抗性基因作为筛选标记，其不易失活，适用于验证和统计谷氨酸棒杆菌的基因整合效率。当修复模板中的kan基因片段(193bp)被正确整合在靶位点，会恢复为完整的卡那抗性基因1107bp，再统计卡那抗性平板转化子数目，即为被正确修饰整合的菌株。因此，严谨的整合模式菌(s-1)保证了crispr-cpf1系统验证的可靠性。

9、(2)本发明构建的诱导型crispr-cpf1双质粒基因整合系统，克服了all-in-one单质粒对于构建重组质粒大小的限制，双质粒分别表达cpf1和crrna等元件，更加有利于构建和表达携带大片段供体dna的重组质粒。

10、(3)本发明利用prpr-prpd2诱导型启动子表达cpf1蛋白，该系统将重组和切割事件分离，建立了crispr-cpf1诱导型双质粒系统，构建了l-丝氨酸重组菌株。本研究建立的编辑系统解决了谷氨酸棒杆菌基因组进行大片段dna整合难题，证明在谷氨酸棒状杆菌中的代谢工程应用改造是可行的。

技术特征：

1.谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.采用权利要求1所述的方法构建的谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统。

3.根据权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌诱导型crispr-cpf1基因组整合系统在构建l-丝氨酸重组菌株方面的应用。

技术总结
本发明涉及谷氨酸棒杆菌诱导型CRISPR‑Cpf1基因组整合系统、构建方法及应用，属于基因工程技术领域，本发明利用诱导型启动子PrpR‑PrpD2表达Cpf1蛋白，构建一个重组质粒含有靶向crRNA和靶基因的同源修复模板，另一个质粒诱导表达Cpf1蛋白的双质粒系统。该系统将重组和切割事件分离，解决了谷氨酸棒杆菌基因组进行大片段DNA整合难题，同时提高了基因编缉效率，为谷氨酸棒杆菌代谢工程研究和菌株构建提供技术保障。

技术研发人员：王婷,姜晓婉,阮欣雅,程鑫浩
受保护的技术使用者：河南科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/8