一种木瓜蛋白酶的提取工艺的制作方法

本发明涉及木瓜，具体为一种木瓜蛋白酶的提取工艺。

背景技术：

1、木瓜又名番木瓜、万寿果。木瓜蛋白酶是一种硫基蛋白酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中，具有耐高温、活性强、稳定性强等特点，具有抗癌、利胆、止痛、助消化等功效，广泛应用于香皂、肥皂、洗衣粉等领域。提取木瓜蛋白酶的传统方法有超滤法、盐析法、有机溶剂法等方法，但是其分离得到的木瓜蛋白酶的纯度不高，因此加强对于木瓜蛋白酶提纯方法的研究具有十分重要的应用价值。

2、双水相萃取是一种温和、高效的分离技术，具有操作简单、分相速度快、操作条件温和、易于放大和进行连续性操作等特点，广泛应用于生物活性物质的分离和纯化。如申请公布号cn107488652a的专利公开了一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法，该发明以咪唑类离子液体为辅助，加入到按照一定质量分数配制的聚乙二醇400/磷酸二氢钠双水相体系中，再向其中加入木瓜蛋白酶溶液进行分相，具有较高的萃取率，但是并不能改善其纯度。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种木瓜蛋白酶的提取工艺，制备得到的木瓜蛋白酶具有较高的纯度和萃取效率。

3、(二)技术方案

4、一种木瓜蛋白酶的提取工艺，所述提取工艺为：

5、(1)在20-35℃下，取新鲜的木瓜去除表皮，取出果肉进行切碎，向其中加入去离子水打浆，抽滤，收集滤液，以3000-4000r/min的转速进行离心10-20min，得到粗酶上清液。

6、(2)将双胍基改性聚乙二醇、硫酸铵分别加入至去离子水中，搅拌均匀，分别配制得到10-40％的双胍基改性聚乙二醇溶液和15-35％的硫酸铵溶液。

7、(3)向粗酶上清液中加入酶活保护剂调节ph为5.5-6.5，静置2-5h，向其中加入10-40％的双胍基改性聚乙二醇溶液和15-35％的硫酸铵溶液，搅拌均匀3-6min，静置20-60min，成相，分为上下两相，得到含木瓜蛋白酶的上相。

8、(4)对含木瓜蛋白酶的上相进行超声波处理，离心，过滤，得到的木瓜蛋白酶。

9、优选的，所述步骤(1)中果肉与去离子水的质量比为30-60:100。

10、优选的，所述步骤(3)中酶活保护剂为edta、l-cys中的一种。

11、优选的，所述步骤(4)中超声波功率为150-300w，时间为100-200s。

12、优选的，所述步骤(4)中离心转速为2000-4000r/min，离心时间为10-20min。

13、优选的，所述步骤(2)中双胍基改性聚乙二醇的制备方法为：

14、(1)将聚乙二醇分散在去离子水中，再向其中加入4-乙烯基苄胺、过硫酸铵引发剂，搅拌分散，升温至90-100℃，搅拌反应1-4h，反应结束后，冷却至室温，丙酮洗涤2-6次，干燥，得到氨基化聚乙二醇。

15、(2)将氨基化聚乙二醇分散在去离子水中，在向其中加入双氰胺，10-40％的盐酸调节ph为3-5，升温至50-70℃，搅拌反应2-5h，反应结束后，乙醇洗涤，干燥，得到双胍基改性聚乙二醇。

16、优选的，所述步骤(1)中聚乙二醇、4-乙烯基苄胺、过硫酸铵的质量比为100:20-60:0.05-0.8。

17、优选的，所述步骤(2)中氨基化聚乙二醇、双氰胺的质量比为100:30-50。

18、(三)有益的技术效果

19、聚乙二醇在过硫酸铵的引发下与4-乙烯基苄胺经过自由基反应，得到氨基化聚乙二醇，再将其与双氰胺在酸性下反应，得到双胍基改性聚乙二醇，最后将双胍基改性聚乙二醇、硫酸铵配制成双胍基改性聚乙二醇溶液和硫酸铵溶液。粗酶上清液在双胍基改性聚乙二醇溶液和硫酸铵的双相萃取下，得到含木瓜蛋白酶的上相，再对上相进行超声波处理，得到的木瓜蛋白酶。

20、本发明制备得到一种双胍基改性聚乙二醇，其中含有双胍基基团，双胍基基团是一种阳离子基团，木瓜蛋白酶表面含有氨基酸残基，具有较多的电子，木瓜蛋白酶能够通过静电作用吸附在含有有双胍基基团的聚乙二醇上。此外本发明制备得到的双胍基改性聚乙二醇中含有苯环大π键，可以与木瓜蛋白酶中的正电性部分形成π络合物，进一步提升木瓜蛋白酶的萃取效率。

21、本发明使用的方法为超声辅助双相萃取法先用双相萃取法得到较多的木瓜蛋白酶，再进一步使用超声提取，既提高了木瓜蛋白酶的萃取效率，又能提升木瓜蛋白酶的纯度。

技术特征：

1.一种木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述提取工艺为：

2.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(1)中果肉与去离子水的质量比为30-60:100。

3.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中酶活保护剂为edta、l-cys中的一种。

4.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中超声波功率为150-300w，时间为100-200s。

5.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中离心转速为2000-4000r/min，离心时间为10-20min。

6.根据权利要求1所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)中双胍基改性聚乙二醇的制备方法为：

7.根据权利要求6所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(1)中聚乙二醇、4-乙烯基苄胺、过硫酸铵的质量比为100:20-60:0.05-0.8。

8.根据权利要求6所述的木瓜蛋白酶的提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)中氨基化聚乙二醇、双氰胺的质量比为100:30-50。

技术总结
本发明涉及木瓜技术领域，且公开了一种木瓜蛋白酶的提取工艺，聚乙二醇在过硫酸铵的引发下与4‑乙烯基苄胺经过自由基反应，得到氨基化聚乙二醇，再将其与双氰胺在酸性下反应，得到双胍基改性聚乙二醇，最后将双胍基改性聚乙二醇、硫酸铵配制成双胍基改性聚乙二醇溶液和硫酸铵溶液。粗酶上清液在双胍基改性聚乙二醇溶液和硫酸铵的双相萃取下，得到含木瓜蛋白酶的上相，再对上相进行超声波处理，得到的木瓜蛋白酶。本发明提供一种木瓜蛋白酶的提取工艺，提取得到的木瓜蛋白酶具有高的萃取效率和纯度。

技术研发人员：樊兆森,李克明,刘超,韩金龙,侯宪博,樊兆艳,部震,孙辉,曾兆建,吕伟伟,逯月,轩云梦,吴培成
受保护的技术使用者：山东佰诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8