一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、鱼类主要的可食用部分是肌肉。肌肉脂质的积累情况与鱼肉的营养价值和鱼肉品质密切相关。大量研究表明，鲑鱼、鲱鱼和鲭鱼等鱼体中大量含有的多不饱和脂肪酸[如epa20:5(n-3)和dha 22:6(n-3)]对人体健康有益。除了能提高人体免疫力外，高不饱和脂肪酸还有益于预防心脑血管疾病、保护视力、促进婴儿的神经系统和视力发育。鱼肉中脂质含量较高也能增加鱼肉的嫩度、风味，使鱼肉的口感更好。除了脂质会影响鱼肉嫩度以外，鱼的肌纤维粗细也会影响嫩度。较细的肌纤维能使鱼肉口感更嫩。

2、然而，目前并未有能特定养殖肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼的方法。

技术实现思路

1、本发明提供的一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明公开了一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)构建针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列，并设计靶位点grna；

5、(2)将敲除斑马鱼pnpla2基因的靶位点grna和cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎中，获得pnpla2基因缺陷型突变体。

6、其中，本发明中的pnpla2基因又叫atgl基因，其实质上属于同一的基因的不同名字。

7、在本发明的较佳实施方式中，步骤(1)中，所述针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列具有如seq id no.1所示的核苷酸序列：gggtatttatcacatcggag。

8、在本发明的较佳实施方式中，步骤(1)中，设计靶位点grna，包括如下步骤：

9、(1)将针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列接入sgrna质粒中；

10、(2)以sgrna质粒为模板，利用上游引物sgrna-f和下游引物sgrna-r进行pcr扩增，获得gdna，割胶回收，进行gdna纯化；所述上游引物sgrna-f具有如seq id no.2所示的核苷酸序列：taatacgactcactatagggtatttatcacatcggaggttttagagctagaaatagc；所述下游引物sgrna-r具有如seq id no.3所示的核苷酸序列：agcaccgactcggtgccact。

11、(3)对gdna进行转录，获得grna。

12、进一步的，pcr扩增体系如下：模板1μl、10×buffer 5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、dntp 5μl、taq酶0.5μl、ddh2o 34.5μl，合计50μl；

13、pcr扩增程序如下：94℃5min、94℃30s、56℃30s、72℃15s、35个循环、、72℃5min、4℃1h。

14、进一步的，转录体系为：ntp 8μl，其中，每种各加2ul、5×buffer 4μl、gdna模板5.5μl、t7 enzyme 2μl、rnase inhibitor 0.5μl，合计20μl，以获得grna；

15、转录程序为：37℃水浴放置6h后，每管加入1.5μl dnase，混匀，37℃水浴15min。

16、在本发明的较佳实施方式中，步骤(2)中，注射体系为：grna 0.2μl、cas9蛋白0.5μl、cas9 buffer 0.3μl，合计1μl，grna终浓度为400ng/μl。

17、第二方面，本发明还公开了一种如第一方面所述的方法在培育肌纤维直径较细、肌肉脂质积累的斑马鱼中的应用。

18、在本发明的较佳实施方式中，所述应用包括如下步骤：

19、(1)获取pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的基因dna；

20、(2)以基因dna为模板，利用上游引物dna-f和下游引物dna-r进行pcr扩增，筛选具有突变的f0代斑马鱼；所述上游引物dna-f具有如seq id no.4所示的核苷酸序列：gcttatctctcctcggccac；所述下游引物dna-r具有如seq id no.5所示的核苷酸序列：cttgtcttcagtgccatcgt；

21、(3)将携带突变的f0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配产生f1代，从f1代中筛选出pnpla2基因缺失的突变体，再让其雌雄交配，获得f2代斑马鱼，再从f2代斑马鱼中筛选出纯合子；

22、(4)将f2代纯合子斑马鱼雌雄交配，获得f3代斑马鱼，即获得肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼。

23、第三方面，本发明公开了一种检测pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的引物对，所述引物对包括上游引物dna-f和下游引物dna-r，所述上游引物dna-f具有如seq id no.4所示的核苷酸序列：gcttatctctcctcggccac；所述下游引物dna-r具有如seq id no.5所示的核苷酸序列：cttgtcttcagtgccatcgt。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、1、本发明首次在斑马鱼中利用crispr-cas9技术获得pnpla2基因缺失突变体，形成可以稳定遗传的突变体品系；

26、2、本发明通过crispr-cas9技术构建pnpla2基因缺失的斑马鱼突变体，与传统的基因编辑技术相比具有毒性小、准确性高、效率高、成本低、易操作、成功周期短等特点，而相对于传统遗传学操作方法，crispr-cas9系统能对预编辑的目标序列进行剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避免了传统操作方法中常遇到的可用选择标计已有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患等；

27、3、本发明构建的斑马鱼pnpla2基因缺失突变体能用于培养获得肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼，为斑马鱼的遗传育种奠定基础；

28、4、与野生型斑马鱼相比，突变型斑马鱼的肌肉脂质和脂肪酸组成发生显著变化，其中，肌肉甘油三酯的比例显著增加，亚麻酸18:3ω-3、epa 20:5(n-3)、dha 22:6等多不饱和脂肪酸的比例均显著增加。

技术特征：

1.一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列具有如seq id no.1所示的核苷酸序列：gggtatttatcacatcggag。

3.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，设计靶位点grna，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，pcr扩增体系如下：模板1μl、10×buffer 5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、dntp 5μl、taq酶0.5μl、ddh2o 34.5μl，合计50μl；

5.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，转录体系为：ntp 8μl，其中，每种各加2ul、5×buffer 4μl、gdna模板5.5μl、t7 enzyme 2μl、rnase inhibitor 0.5μl，合计20μl，以获得grna；

6.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，注射体系为：grna 0.2μl、cas9蛋白0.5μl、cas9 buffer 0.3μl，合计1μl，grna终浓度为400ng/μl。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法在培育肌纤维直径较细、肌肉脂质积累的斑马鱼中的应用。

8.根据权利7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

9.一种检测pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物dna-f和下游引物dna-r，所述上游引物dna-f具有如seq id no.4所示的核苷酸序列：gcttatctctcctcggccac；所述下游引物dna-r具有如seq id no.5所示的核苷酸序列：cttgtcttcagtgccatcgt。

技术总结
本发明公开了一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。包括如下步骤：(1)构建针对pnpla2基因特异的CRISPR‑Cas9的靶序列，并设计靶位点gRNA；(2)将敲除斑马鱼pnpla2基因的靶位点gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎中，获得pnpla2基因缺陷型突变体。本发明首次在斑马鱼中利用CRISPR‑Cas9技术获得pnpla2基因缺失突变体，形成可以稳定遗传的突变体品系；构建的斑马鱼pnpla2基因缺失突变体能用于培养获得肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼，为斑马鱼的遗传育种奠定基础；与野生型斑马鱼相比，突变型斑马鱼的肌肉脂质和脂肪酸组成发生显著变化，其中，肌肉甘油三酯的比例显著增加，亚麻酸18:3ω‑3、EPA20:5(n‑3)、DHA22:6等多不饱和脂肪酸的比例均显著增加。

技术研发人员：钱玙呈,乔芳,杜震宇,任炯
受保护的技术使用者：华东师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17