一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用

本发明涉及细胞工程，更具体的说是涉及一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用。

背景技术：

1、西红花苷为脱辅基类胡萝卜素类化合物，根据其分子两端连接的糖基数目及位置差异可分为五种类型。西红花苷主要存在于中药番红花(crocus sativus)的柱头和栀子(gardenia jasminoides)的成熟果实中。现代药理学研究证明其具有抗癌、抗炎、抗抑郁等药理作用，但其价格昂贵、资源短缺等问题极大的限制了西红花苷的新药研发和临床应用。目前西红花苷的来源主要依赖于植物化学提取分离，存在产率低，耗时长等缺点，因此研究开发其他有效途径用于合成西红花苷有着非常重要的意义。

2、基于多组学研究，栀子西红花苷生物合成途径已被清晰阐明，其下游生物合成途径分为三步：首先，c40-类胡萝卜素类前体化合物被类胡萝卜素裂解双加氧酶(gjccd4a)裂解产生西红花酸二醛；接着，西红花酸二醛被乙醛脱氢酶(gjaldh2c3)氧化为西红花酸；最后，西红花酸在两个糖基转移酶(gjugt74f8和gjugt94e13)的作用下生成五种类型西红花苷。这些关键基因元器件的鉴定为西红花苷合成生物学研究奠定了坚实的基础。

3、大肠杆菌底盘细胞具有易培养、蛋白异源表达量高、培育周期短、对投入人力物力要求不高等特点，但其缺乏对蛋白的翻译后修饰功能，在表达真核生物基因时具有较大难度。此外，多个基因同时整合入同一个大肠杆菌底盘细胞并进行异源表达具有挑战性，实验人员需经过大量实验摸索，探究符合多个基因同时表达发挥功能的适宜条件。

4、因此，提供一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用。本发明利用11个基因将西红花苷代谢通路构建至大肠杆菌底盘细胞，实现葡萄糖至五种类型西红花苷的异源合成，为西红花苷大规模工业化生产奠定基础；

2、保藏信息：e579-crocins，分类命名为大肠埃希氏菌escherichia coli；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc：no.29364，保藏日期为2023年12月21日。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌，保藏编号为cgmcc：no.29364。

5、本发明还提供了一种微生物菌剂，包括上述产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌。

6、本发明还提供了一种微生物发酵液，使用上述产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌进行发酵得到。

7、本发明还提供了上述工程菌、上述微生物菌剂或上述发酵液在发酵制备或药物研发中的应用。

8、优选的：实现葡萄糖至西红花苷的异源合成，西红花苷包括西红花苷iii，西红花苷iv和西红花苷v。

9、优选的：包括诱导条件：1.0mm iptg，5％葡萄糖终浓度的fm培养基，16℃诱导84h。

10、本发明还提供了一种gjccd4a的突变基因n212或n212m，n212的核苷酸序列如seqid no.1所示；n212m的核苷酸序列如seq id no.2所示。

11、本发明还提供了上述突变基因的表达载体。

12、本发明还提供了一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括依次将paccar25δcrtx、p2c3-n212m、pslb208-pgm-t7-galu与pcdf-duet-1-ugt74f8-ugt94e13转化至大肠杆菌感受态中。

13、优选的：p2c3-n212m的构建方法：以pet-duet-1为载体利用p-2c3-x-f和p-x-2c3-r引物组，将gjaldh2c3构建至pet-duet-1载体的多克隆位点1，利用p2c3-n212m-f和p2c3-n212m-r引物组，将n212m构建至pet-duet-1载体的多克隆位点2；

14、n212m的核苷酸序列如seq id no.2所示；

15、gjaldh2c3的核苷酸序列如seq id no.3所示；

16、p-2c3-x-f的核苷酸序列如seq id no.4所示；

17、p-x-2c3-r的核苷酸序列如seq id no.5所示；

18、p2c3-n212m-f的核苷酸序列如seq id no.6所示；

19、p2c3-n212m-r的核苷酸序列如seq id no.7所示。

20、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用，取得的技术效果为本发明能够实现葡萄糖至五种类型西红花苷的生物合成，其中包括从植物中难以提取或植物含量很低的西红花苷iii，西红花苷iv和西红花苷v，将为五种类型西红花苷的获取提供支撑，推动五种西红花苷的新药研发进展。

技术特征：

1.一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌，其特征在于，保藏编号为cgmcc：no.29364。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌。

3.一种微生物发酵液，其特征在于，使用权利要求1所述产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌进行发酵得到。

4.权利要求1所述工程菌、权利要求2所述微生物菌剂或权利要求3所述发酵液在发酵制备或药物研发中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，实现葡萄糖至西红花苷的异源合成，所述西红花苷包括西红花苷iii，西红花苷iv和西红花苷v。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，包括诱导条件：1.0mm iptg，5％葡萄糖终浓度的fm培养基，16℃诱导84h。

7.一种gjccd4a的突变基因n212或n212m，其特征在于，所述n212的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述n212m的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8.一种包含权利要求7所述突变基因的表达载体。

9.一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括依次将paccar25δcrtx、p2c3-n212m、pslb208-pgm-t7-galu与pcdf-duet-1-ugt74f8-ugt94e13转化至大肠杆菌感受态中。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述p2c3-n212m的构建方法：以pet-duet-1为载体利用p-2c3-x-f和p-x-2c3-r引物组，将gjaldh2c3构建至pet-duet-1载体的多克隆位点1，利用p2c3-n212m-f和p2c3-n212m-r引物组，将n212m构建至pet-duet-1载体的多克隆位点2；所述n212m的核苷酸序列如seq id no.2所示；

技术总结
本发明公开了一种产五种类型西红花苷的大肠杆菌工程菌及其应用。属于细胞工程技术领域。工程菌的保藏编号为CGMCC：NO.29364，并提供了相关基因、应用。本发明能够实现葡萄糖至五种类型西红花苷的生物合成，其中包括从植物中难以提取或植物含量很低的西红花苷III，西红花苷IV和西红花苷V，将为五种类型西红花苷的获取提供支撑，推动五种西红花苷的新药研发进展。

技术研发人员：浦香东,宋经元,李思齐,周泽,李余芳,胡艳
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29