一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法与流程

本发明涉及固定化酶，具体为一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法。

背景技术：

1、烟酸又称维生素b3，在生物体的生命活动中起着重要作用，烟酸具有抗氧化活性，可以保护蛋白质免受辐射的损害；食用含有烟酸的饮食可以降低牛、火鸡或猪等的脂肪含量，从而改善肉质，此外，烟酸还可以作为原料来合成新的化学中间体，例如烟酰胺、6-羟基烟酸等。

2、利用含有腈水解酶的微生物催化生产酰胺类化合物具有反应效率高、专一性好及条件温和等优点，但游离细胞在反应过程中易发生破碎，释放出所含腈水合酶和细胞组分，不仅酶容易失活，而且细胞无法重复利用，只能转化单批次反应，同时会导致产物分离纯化困难等问题，而细胞固定化技术可以有效解决上述问题，具有重要的工业应用价值。

3、固定化技术主要包括细胞的固定化及游离酶的固定化，据目前的研究报道，绝大多数腈类化合物生物催化都是采用固定化后的生物催化剂进行的，直接采用游离细胞进行生物催化的工艺相对较少。例如，kumar等利用共价交联聚合的方式对恶臭假单胞菌腈水解酶进行了固定化，研究表明固定化后的p.putida腈水解酶能够在4℃的条件下稳定存在75h，然而游离酶在此温度条件下保存75h活力却降低了90％。另外，nigam等以琼脂-琼脂作为基质固定化链霉菌腈水解酶用来进行丙烯腈的生物催化反应，利用该方法固定化后的腈水解酶酶活力丧失很少，仅丧失约20％，并可以重复使用25次。利用海藻酸钙对a.faecalis腈水解酶进行固定化也可以提高其循环利用率，该方法固定后的酶在连续使用30个循环后酶活力几乎没有丧失，而游离细胞却仅能够使用9个循环；除此之外，利用聚乙烯亚胺和戊二醛交联藻酸钙微珠能够使循环利用效率进一步提高到40次反应。

4、总体而言，目前所采用的包埋固定化方法操作相对简单，固定化效果较好，但是依然存在一定的问题，如海藻酸钙固定化细胞在使用过程中机械强度会逐渐降低，且无法在磷酸盐中稳定存在；另一种固定化方式采用环氧型树脂为吸附载体，结合腈水解酶破胞酶液进行腈水解酶的固定化，外观为乳白色不透明球体，粒度分布为100-300μm，该载体同时含有亲水和疏水骨架，孔径均一，孔隙率高，具有较高的比表面积和机械强度，该树脂与酶(蛋白)具有较好的结合能力及生物适应性，载量大，酶活高，传质快，反应彻底，使用批次多，可大大提高酶催化反应的效率，降低成本。因此，急需一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法来解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，制备的固定化酶可以在腈类物质中稳定存在，具有机械强度高、酶活损失率低及易于保存的特点，进行催化三氰基吡啶生产烟酸时，具有副产物少、产物得率高、反应液澄清等特点，其成本较低，操作方便，反应温和，污染小，重复使用次数较多，具有一定的工业化使用潜力，解决了上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，包括如下步骤：

4、s1、固定化酶液的制备：

5、s11、试剂的配制：

6、配置0.02m k2hpo4·3h2o及0.02m kh2po4；

7、将100ml的0.02m k2hpo4·3h2o和32.5ml的0.02m kh2po4混合均匀，现配现用，配置0.02m ph＝7.8的磷酸盐缓冲液；

8、s12、固定化酶与载体结合：

9、配制酶和磷酸盐缓冲液：酶和蒸馏水的体积比为1：9，配好酶液后，加入磷酸盐缓冲液；

10、s2、酶的固定化；

11、准确称取0.5g树脂放入15ml的具塞锥形瓶中，再用移液管准确加入配制的酶和磷酸盐缓冲液10ml，控温25-28℃摇床慢摇24h；

12、将固定化的树脂转移至40ml的磨砂玻璃漏斗中，用2％的盐水洗涤1000ml水，再用纯水洗涤400ml水，然后放在滤纸上吸掉游离水；

13、s3、固定化酶催化条件探究：

14、s31、温度及ph条件确定：

15、按照控制单一变量法确定反应的温度及ph；

16、在其他条件一定的情况下，设置反应ph梯度，以8h内三氰基吡啶的转化率为参考指标，确定最适ph为8.0；

17、在其他条件一定的情况下，设置反应温度梯度，以8h内三氰基吡啶的转化率为参考指标，确定最适温度为30℃；

18、s32、固定化酶重复反应批次确定：

19、将第一次催化反应使用后的固定化细胞进行回收利用进行第二批次反应，以此类推，以烟酸的生成量为参照指标，计算固定化酶的回收批次。

20、优选的，所述s11中，0.02m k2hpo4·3h2o的配制为称取4.56g的k2hpo4溶于1l的h2o中。

21、优选的，所述s11中，0.02m kh2po4的配制为称取1.36g的kh2po4溶于500ml的h2o中。

22、优选的，所述s12中，磷酸盐缓冲液的加入量为：k2hpo4的单位质量与体积比为总量的25％，kh2po4的单位质量与体积比为总量的2.2％。

23、优选的，所述s31中，设置反应ph梯度，按照6.5、7.0、7.5、8.0、8.5为唯一变量。

24、优选的，所述s31中，设置反应温度梯度，按照20℃、25℃、30℃、35℃为唯一变量。

25、优选的，所述s32中，在不影响酶活的前提下，固定化细胞能连续进行18批次的催化反应，18批次后，随着反应批次的增加，三氰基吡啶的转化率在缓慢降低，随着时间的延长三氰基吡啶出现累积，最终，固定化细胞重复反应能进行不低18批次。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

27、本发明制备的固定化酶可以在腈类物质中稳定存在，具有机械强度高、酶活损失率低及易于保存的特点，进行催化三氰基吡啶生产烟酸时，具有副产物少、产物得率高、反应液澄清等特点，其成本较低，操作方便，反应温和，污染小，重复使用次数较多，具有一定的工业化使用潜力。

技术特征：

1.一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s11中，0.02m k2hpo4·3h2o的配制为称取4.56g的k2hpo4溶于1l的h2o中。

3.根据权利要求2所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s11中，0.02m kh2po4的配制为称取1.36g的kh2po4溶于500ml的h2o中。

4.根据权利要求3所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s12中，磷酸盐缓冲液的加入量为：k2hpo4的单位质量与体积比为总量的25％，kh2po4的单位质量与体积比为总量的2.2％。

5.根据权利要求4所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s31中，设置反应ph梯度，按照6.5、7.0、7.5、8.0、8.5为唯一变量。

6.根据权利要求5所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s31中，设置反应温度梯度，按照20℃、25℃、30℃、35℃为唯一变量。

7.根据权利要求6所述的一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，其特征在于，所述s32中，在不影响酶活的前提下，固定化细胞能连续进行18批次的催化反应，18批次后，随着反应批次的增加，三氰基吡啶的转化率在缓慢降低，随着时间的延长三氰基吡啶出现累积，最终，固定化细胞重复反应能进行不低18批次。

技术总结
本发明公开了一种固定化腈水解酶生产烟酸的方法，属于固定化酶技术领域，包括如下步骤：S1、固定化酶液的制备：S11、试剂的配制；S12、固定化酶与载体结合；S2、酶的固定化；S3、固定化酶催化条件探究：S31、温度及pH条件确定；S32、固定化酶重复反应批次确定。本发明解决了现有的固定化酶，其重复使用次数较少，稳定性差，且酶活损失率较高的问题，本发明制备的固定化酶可以在腈类物质中稳定存在，具有机械强度高、酶活损失率低及易于保存的特点，进行催化三氰基吡啶生产烟酸时，具有副产物少、产物得率高、反应液澄清等特点，其成本较低，操作方便，反应温和，污染小，重复使用次数较多，具有一定的工业化使用潜力。

技术研发人员：刘博超,周媛,史玉龙,王本超,杨亚航
受保护的技术使用者：安徽瑞邦生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22