一种EPO刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用

本发明属于生物医药，尤其涉及一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用。

背景技术：

1、促红细胞生成素（epo）是红细胞调节生长因子，可直接促进成骨功能，加速骨修复，并具有潜在的抗炎作用。然而，epo也可以促进属于巨噬细胞谱系的raw264.7细胞的增殖，从而增加宿主免疫反应失调的风险。越来越多的证据表明，免疫系统和骨骼系统共享许多调节分子，包括细胞因子、受体、信号分子和转录因子。巨噬细胞是先天免疫系统的主要细胞，它可以通过其强大的杀菌和吞噬作用杀死致病菌。作为宿主免疫的重要组成部分，在组织稳态、宿主防御感染和组织修复中发挥着重要作用。从促炎（m1）适当且及时地过渡到抗炎（m2）巨噬细胞对于治疗炎症性骨缺损是必不可少的。

2、与细胞治疗相比，外泌体具有免疫清除率低、储存时间长、无毒、更有效和更安全地传递活性物质等优点。因此，外泌体正在成为组织再生的细胞治疗的替代疗法。外泌体的生物学功能在很大程度上取决于其源细胞。许多研究表明，巨噬细胞来源的外泌体可应用于炎症性骨缺损的无细胞治疗，通过重塑免疫微环境和传递mirnas等生物活性分子，促进骨再生。

3、牙周炎是一种慢性多因素炎症性疾病，以牙周组织破坏为特征，常引起牙龈炎症、外周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动和移位，是成人牙齿脱落的主要原因。牙周炎的快速进展与组织炎症和宿主免疫反应的过度激活密切相关。过度的宿主免疫炎症反应导致骨组织的持续丢失，即使在治疗后也不能完全修复。改善牙周免疫微环境，同时促进牙周骨组织再生仍是一个持续的挑战。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤1、使用epo刺激对数期生长的m0巨噬细胞24h，随后收集细胞培养上清液；

4、步骤2、将步骤1得到的细胞培养上清液进行梯度离心，收集沉淀，洗涤后收集上清；

5、步骤3、将步骤2得到的含有外泌体的上清通过外泌体纯化柱，离心，收集滤过液体，即得epo刺激巨噬细胞来源外泌体。

6、进一步的技术方案，在所述步骤1中，采用的epo浓度为20u/ml。

7、进一步的技术方案，在所述步骤1中，巨噬细胞对数期生长密度控制在20万个/cm2。

8、进一步的技术方案，在所述步骤1中，巨噬细胞为巨噬细胞系raw 264.7细胞。

9、进一步的技术方案，在所述步骤2中，细胞培养上清液的梯度离心包括以下具体步骤：

10、温度为4℃， 进行1000g离心10分钟，去除培养基中的碎片和死细胞，收集上清，然后通过0.22μm过滤器过滤，再次收集上清；

11、温度为4℃，进行100000g离心4小时，收集沉淀并用pbs重悬；

12、温度为4℃，进行100000g离心20分钟，洗涤沉淀，收集沉淀，即可获得epo-exo，将epo-exo重悬在200μl无菌无酶水中，-80℃保存备用。

13、本发明实施例的另一目的在于，一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的应用，将所述外泌体应用于治疗炎症性骨缺损类疾病中。

14、本发明实施例的另一目的在于，一种治疗炎症性骨缺损的生物制剂，包括50-100μg/ml的经分离纯化的epo刺激巨噬细胞产生的外泌体，还包括赋形剂、溶剂和其他添加组分（为常规组分选择）。

15、进一步的技术方案，所述外泌体在软骨损伤治疗制剂中的浓度可以为50 μg/ml、55 μg/ml、60 μg/ml、65 μg/ml、70 μg/ml、75 μg/ml、80 μg/ml、85 μg/ml、90 μg/ml、95 μg/ml或100μg/ml，也可以是上述范围内的任意数值。

16、作为本发明的一种优选实施例，所述赋形剂为水凝胶，所述外泌体被束缚在水凝胶的三维网络中。

17、进一步的技术方案，所述治疗炎症性骨缺损的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

18、步骤a、提供从epo刺激巨噬细胞产生的外泌体；

19、步骤b、提供赋形剂以及其他添加组分；

20、步骤c、将外泌体、赋形剂以及其他添加组分在溶剂中进行混合，后进行共孵育，以得到治疗炎症性骨缺损的生物制剂。

21、进一步的技术方案，所述步骤c中的溶剂为磷酸缓冲盐溶液。

22、本发明实施例提供的一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用，制备的外泌体可参与成骨微环境的免疫调控以及促炎症下成骨再生。使用20u/ml epo作用于对数期生长的巨噬细胞，24h后收集上清，以获得新型巨噬细胞外泌体。所述epo刺激巨噬细胞来源外泌体恢复炎症状态下对干细胞成骨的抑制作用，另一方面这种新型外泌体可以作用于炎症状态下成骨微环境中的相关巨噬细胞，进一步重新极化m1型巨噬细胞为m2型巨噬细胞，其效果比m0型巨噬细胞外泌体更加显著，从而有效抑制炎症环境，实现对成骨免疫微环境稳态的调控，促进骨组织再生修复。同时，epo刺激巨噬细胞来源外泌体的体内生物安全性好，可以参与细胞间的通信，调节局部免疫微环境，在牙周炎的局部注射治疗中有较好的效果，具有广阔的应用前景和临床价值。

技术特征：

1.一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，采用的epo浓度为20u/ml。

3.根据权利要求1所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，巨噬细胞对数期生长密度控制在20万个/ cm2。

4.根据权利要求3所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，巨噬细胞为巨噬细胞系raw 264.7细胞。

5.根据权利要求2所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，细胞培养上清液的梯度离心包括以下具体步骤：

6.一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的应用，基于上述权利要求1-5任一项所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法所制备的外泌体，其特征在于，将所述外泌体应用于治疗炎症性骨缺损类疾病中。

7. 一种治疗炎症性骨缺损的生物制剂，基于上述权利要求1-5任一项所述的epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备方法所制备的外泌体，其特征在于，包括50-100μg /ml的外泌体，还包括溶剂和赋形剂。

8.根据权利要求7所述的治疗炎症性骨缺损的生物制剂，其特征在于，所述外泌体在软骨损伤治疗制剂中的浓度为50 μg/ml至100 μg/ml范围内的任意数值。

9.根据权利要求7所述的治疗炎症性骨缺损的生物制剂，其特征在于，所述赋形剂为水凝胶，所述外泌体被束缚在水凝胶的三维网络中。

10.根据权利要求7所述的治疗炎症性骨缺损的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

技术总结
本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种EPO刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用，制备方法包括以下步骤：步骤1、使用EPO刺激对数期生长的M0巨噬细胞24h，随后收集细胞培养上清液；步骤2、将细胞培养上清液进行梯度离心，收集沉淀，洗涤后收集上清；步骤3、将含有外泌体的上清通过外泌体纯化柱，离心，收集滤过液体，即得EPO刺激巨噬细胞来源外泌体。该方法构建了兼具抗炎和成骨功能的外泌体，该外泌体能重新编程M1型巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，效果显著，实现对成骨免疫微环境稳态的调控，促进炎症环境下的骨组织再生修复。同时，该方法简便，无免疫原性问题，体内生物安全性高。

技术研发人员：李道伟,刘姝辰,孙宏晨,黄蕾,张媛
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25