基于颜色编码的免扩增CRISPR/Cas12/13多样本多核酸检测方法

：本发明属于生物检测，涉及一种核酸检测方法，具体为一种基于颜色编码的免扩增crispr/cas12/13多样本多重核酸检测方法。

背景技术

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背景技术：

1、共感染是同时感染2种以上的病原体，以病毒、细菌、支原体的组合为主，常见临床共感染病原体如肺炎链球菌、肺炎支原体，结核分枝杆菌、如腺病毒、流感病毒等。共感染会导致病情加重、病程延长、治疗用药增多、治疗难度加大。此外，呼吸道病原体感染高发期，需要在短时间内批量检测大量不同人群的样本及其可能的感染类型。

2、pcr等传统检测技术无法兼具多样本与多病原微生物靶标检测，多样本检测往往只能检测单一靶标，而多靶标检测一次只能检测一个样本，难以实现快速地对多样本进行多重靶标检测。

3、crispr是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。crispr和cas蛋白协同作用，组成具有核酸切割能力的crispr-cas12/13检测系统，具有很强靶标特异性，可以识别特异性序列，近年来已经被应用于基因的精准检测领域。其中，crispr/cas12/13系统可以根据设计的crrna对目标双链dna进行识别与捕获，激活cas12/13的dna酶切活性，从而对体系中的dna荧光探针进行高效反式切割，实现靶标双链dna的特异性检测。

4、微容量crispr-cas12/13检测系统通过减小单个反应体系的体积来增加靶标浓度，将靶标核酸和crispr/cas12/13反应试剂富集到微滴中，以此增加靶标核酸的局部浓度，不需要扩增，使其达到cas蛋白识别靶标的最低浓度要求。与常规大体积反应体系相比，其检测灵敏度大幅提高，可达到单分子dna水平。但是，现有的微容量crispr-cas12/13检测系统也都只能针对1个样本检测1个靶标，并不满足临床多样本、多靶标同时检测需求。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、针对背景技术中提出的多样本、多靶标同时检测以及免扩增检测中存在的一系列技术问题，本发明的目的在于提供一种基于颜色编码的免扩增crispr/cas多样本多核酸检测方法，该方法能有效解决以上技术问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种基于颜色编码的免扩增crispr/cas12/13多样本多核酸检测方法，该方法为：将不同颜色的染料分别与不同样本、针对不同靶标的crispr/cas12/13检测体系混合，并分别制备为大量单分散样本微滴和crispr微滴；将大量的样本微滴和crispr微滴两种液滴随机配对融合后形成具有特殊颜色编码的反应微滴，并进行crispr/cas免扩增反应；通过采集crispr/cas12/13切割报告探针产生的荧光信号，能够区分阳性微滴与阴性微滴；通过分析反应微滴的明场颜色，追溯微滴的样本和crispr/cas12/13检测体系来源。结合荧光信号和明场颜色综合判断液滴的来源和结果，可以实现多样本、多靶标的高通量检测。本发明方法通过使用反应微滴提高靶标在所述体系中的相对浓度，因此不需要扩增。

4、进一步，上述的检测方法具体包括以下步骤：

5、s1：将不同浓度的偏蓝绿色的染料与不同来源的样本混合，并制备样本微滴；

6、s2：将不同浓度的偏红橙色的染料与针对不同靶标的crispr/cas12/13检测体系混合，并制备crispr微滴，所述的crispr微滴与所述的样本微滴直径不同；

7、s3：将步骤s1中所述的样本微滴与步骤s2中所述crispr微滴随机配对、融合，形成具有特殊颜色编码的反应微滴并进行反应；

8、s4：分析步骤s3中所述的反应微滴的荧光信号，判断阳性微滴以及阴性微滴；

9、s5：分析步骤s3中所述的反应微滴的明场图像，判断阳性微滴的样本来源、靶标种类。

10、进一步优选的：所述的crispr微滴直径为120μm，所述的样本微滴直径为80μm。

11、进一步优选的：步骤s3中所述反应的条件为37℃反应1小时。

12、进一步优选的：所述的crispr/cas12/13检测体系包括(1)、(2)和(3)中所述的成分：(1)cas12a或cas13a，(2)ssdna报告子或ssrna报告子，(3)crrna。本发明的具体实施方式中，选用cas13a蛋白时，使用ssrna报告子；选用cas12a蛋白时，使用ssdna报告子。

13、进一步优选的：所述的ssdna报告子或ssrna报告子两端标记有fam荧光基团和淬灭基团；所述的crrna针对不同靶标设计，每一种crrna只能结合一种特定的靶标。

14、更进一步优选的：当crrna与靶标结合后，所述的cas12a或cas13a的反式切割活性被激活，切割ssdna报告子或ssrna报告子，释放fam荧光基团，产生荧光信号。

15、进一步优选的：步骤s3中所述的颜色编码具有特殊的rgb值，可以被knn算法分类；根据颜色编码的rgb值分析特征向量，所述的特征向量对应着特定的标签，根据该标签可追溯样本来源以及靶标类型。

16、进一步优选的：步骤s3中所述的微滴随机配对、融合是在芯片中进行；所述的芯片具有两种不同直径的微孔，大微孔直径为130μm，深度为110μm，容纳crispr微滴；小微孔直径为90μm，深度为65μm，容纳样本微滴；所述融合的方式为使用电晕处理机以20w输出功率处理5秒。

17、本发明具有以下优点：

18、(1)基于颜色编码方法实现多种靶标的同时检测，无需多重荧光探针，节省检测成本，提高检测效率。

19、(2)微容量crispr体系可以将cripr反式切割产生的大量荧光局限在一个微滴中，大幅提高检测灵敏度，同时可指数级降低背景噪音和10亿倍级别降低荧光信号的扩散稀释，实现免扩增crispr检测，简化检测步骤，节省检测时间，避免气溶胶污染。

20、(3)同时检测多来源样本，实现高通量检测，节省检测时间，且各样本间没有批间差，利于样本间对照分析。

技术特征：

1.一种基于颜色编码的免扩增crispr/cas12/13多样本多核酸检测方法，其特征在于，该方法为：将不同颜色的染料分别与不同样本、针对不同靶标的crispr/cas12/13检测体系混合，并分别制备为大量单分散样本微滴和crispr微滴；将大量的样本微滴和crispr微滴两种液滴随机配对融合后形成具有特殊颜色编码的反应微滴，并进行crispr/cas免扩增反应；通过采集crispr/cas12/13切割报告探针产生的荧光信号，能够区分阳性微滴与阴性微滴；通过分析反应微滴的明场颜色，追溯微滴的样本和crispr/cas12/13检测体系来源。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述的crispr微滴直径为120μm，所述的样本微滴直径为80μm。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤s3中所述反应的条件为37℃反应1小时。

5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的crispr/cas12/13检测体系包括(1)、(2)和(3)中所述的成分：(1)cas12a或cas13a，(2)ssdna报告子或ssrna报告子，(3)crrna。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：

7.据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：当crrna与靶标结合后，所述的cas12a或cas13a的反式切割活性被激活，切割ssdna报告子或ssrna报告子，释放fam荧光基团，产生荧光信号。

8.据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤s3中所述的颜色编码具有特殊的rgb值，可以被knn算法分类；根据颜色编码的rgb值分析特征向量，所述的特征向量对应着特定的标签，根据该标签可追溯样本来源以及靶标类型。

9.据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤s3中所述的微滴随机配对、融合是在芯片中进行；所述的芯片具有两种不同直径的微孔，大微孔直径为130μm，深度为110μm，容纳crispr微滴；小微孔直径为90μm，深度为65μm，容纳样本微滴；所述融合的方式为使用电晕处理机以20w输出功率处理5秒。

技术总结
本发明公开了一种基于颜色编码的免扩增CRISPR/Cas12/13多样本多核酸检测方法。本发明的检测方法包括：将染料分别与不同样本、针对不同靶标的CRISPR/Cas12/13检测体系混合，并分别制备为大量单分散微滴；大量的两种液滴随机配对融合后，进行CRISPR/Cas免扩增反应；采集反应产生的荧光信号，可以区分阳性微滴与阴性微滴；分析微滴的明场颜色，可追溯微滴的样本和CRISPR/Cas12/13检测体系来源；结合荧光信号和明场颜色综合判断液滴的来源和结果，可以实现多样本、多靶标的高通量检测。

技术研发人员：高畅,庄添驰,季明辉,杨英淇,梅浩坤,赵昕怡,赵文武,沈洁淼,崔焱
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24