柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法

本发明涉及热带农作物转基因，尤其涉及柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法。

背景技术：

1、柱花草属(stylosanthes sw.)全属大约有50个种，目前，该属已被驯化并栽培利用的主要两个种是圭亚那柱花草(stylosanthes guianensis)和西卡柱花草(stylosanthes scabra)，这两个种在热带与亚热带地区被用作牧草和绿肥。光果柱花草(stylosanthes leiocarpa)是柱花草属的一个野生种，该种的枝条长度30～50cm、分蘖位低、分蘖数大、草层覆盖度好，有作为覆盖作物用于热带地区的林果园间作物的巨大潜力。

2、发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)是一种存在于植物根系附近土壤中的革兰氏阴性菌，该菌具有诱导植物形成毛状根的能力，其主要机制是通过将根诱导(ri)质粒中的细菌dna片段整合到植物基因组中。由发根农杆菌介导产生的毛状根具有可离体生长等特点，因此可被作为一种生物反应器。

3、现有技术中通过发根农杆菌介导并建立的柱花草(stylosanthes guianensis)的转基因毛状根方法的毛状根转化率低，且毛状根阳性率低，不利于对诱导柱花草毛状根的研究，也不利于推动柱花草毛状根的应用。

4、因此亟需建立一种柱花草高效诱导转基因毛状根以及提高毛状根阳性率的方法以解决以上问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法，以解决上述问题。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

3、一种柱花草诱导转基因毛状根的方法，包括以下步骤：

4、s1：外植体的获得：切取萌发后的光果柱花草幼苗的子叶节为外植体；

5、s2：侵染及共培养：将外植体放入携带有目的基因的重组发根农杆菌ar1193侵染液中浸泡，分离得到侵染后的外植体，吸干外植体表面的侵染液，将外植体置于ms固体培养基上暗培养；

6、s3：诱导及筛选：暗培养完成后，使用抑菌剂清洗外植体并吸去表面液体残留，将外置体插入添加抗生素的诱导培养基中进行诱导及筛选，初步得到转基因毛状根；

7、s4：继代培养：将转基因毛状根转移至继代培养基中，继代培养。

8、进一步的，在步骤s1中，取萌发2天后的光果柱花草幼苗，在子叶节下0.5～1.0cm处切除下胚轴，切开两片子叶节，在每片子叶节上分别划出伤口，得到所述外植体。

9、进一步的，在步骤s3中，所述添加抗生素的诱导培养基组成为：2.21g·l-1ms、2％蔗糖、200mg·l-1特美汀、8mg·l-1潮霉素b、3.5g·l-1植物凝胶。

10、进一步的，步骤s2中，所述浸泡的时间为15min，所述重组发根农杆菌侵染液浓度为od600＝0.3～0.5。

11、进一步的，步骤s2中，所述暗培养条件为：在22～25℃，黑暗条件下共培养4天。

12、进一步的，步骤s3中，在温度为22～25℃，光强为38000～38500lux，12h d-1光照条件下，利用所述诱导培养基对毛状根进行诱导和筛选。

13、进一步的，步骤s4中，继代培养的具体过程包括：将转基因毛状根从诱导培养基中转移至固体继代培养基中，25℃黑暗条件下培养，增殖5～10天后，去除子叶，每7天更换一次培养基，更换2～4次培养基后，取毛状根在无菌条件下用手术刀切割下长约5～7cm的根尖部分，将根尖部分置于新配制的液体继代培养基中在相同条件下继代培养；

14、所述固体继代培养基组成为：1/2ms、2％蔗糖、3.5g·l-1植物凝胶；所述液体继代培养基组成为：1/2ms、2％蔗糖。

15、一种制备原生质体的方法，包括以下步骤：

16、ⅰ：酶解：取通过本发明所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法获得的继代培养20天后的转基因毛状根，加入甘露醇溶液，细胞质壁分离后取出毛状根，切片后置于培养皿中，加入酶解液浸没，25℃黑暗条件下振荡酶解7～9h后，加入终止液，终止酶解；

17、ⅱ：获得转基因毛状根原生质体：摇动培养皿释放原生质体，过滤后收集得到转基因毛状根原生质体。

18、进一步的，步骤ⅰ中，所述酶解液组成为：1.5％～2.5％纤维素酶、1.5～2.5％离析酶、0.6m甘露醇、10mm cacl2、10mm mgcl2、10mm mes、1％bsa。

19、本发明的有益效果是：

20、本发明中公开的一种柱花草的转基因毛状根诱导方法，光果柱花草转基因毛状根诱导率达到96.7％，毛状根阳性率高达100％，本方法具有能够高效诱导光果柱花草毛状根且毛状根阳性率高的优点，为柱花草分子生物学研究提供了重要支撑；另外，本发明还成功建立了利用柱花草转基因毛状根制备原生质体的方法，获得的原生质体细胞100％为转基因细胞，填补了该领域的技术空白。

技术特征：

1.一种柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，在步骤s1中，取萌发2天后的光果柱花草幼苗，在子叶节下0.5～1.0cm处切除下胚轴，切开两片子叶节，在每片子叶节上分别划出伤口，得到所述外植体。

3.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述添加抗生素的诱导培养基组成为：2.21g·l-1ms、2％蔗糖、200mg·l-1特美汀、8mg·l-1潮霉素b、3.5g·l-1植物凝胶。

4.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤s2中，所述浸泡的时间为15min，所述重组发根农杆菌侵染液浓度为od600＝0.3～0.5。

5.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤s2中，所述暗培养条件为：在22～25℃，黑暗条件下共培养4天。

6.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤s3中，在温度为22～25℃，光强为38000～38500lux，12h d-1光照条件下，利用所述诱导培养基对毛状根进行诱导和筛选。

7.根据权利要求1所述的柱花草诱导转基因毛状根的方法，其特征在于，步骤s4中，继代培养的具体过程包括：将转基因毛状根从诱导培养基中转移至固体继代培养基中，25℃黑暗条件下培养，增殖5～10天后，去除子叶，每7天更换一次培养基，更换2～4次培养基后，取毛状根在无菌条件下用手术刀切割下长约5～7cm的根尖部分，将根尖部分置于新配制的液体继代培养基中在相同条件下继代培养；

8.一种制备原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备原生质体的方法，其特征在于，步骤ⅰ中，所述酶解液组成为：1.5％～2.5％纤维素酶、1.5～2.5％离析酶、0.6m甘露醇、10mm cacl2、10mm mgcl2、10mmmes、1％bsa。

技术总结
本发明公开了一种柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法，柱花草诱导转基因毛状根的方法包括外植体的获得：切取萌发后的光果柱花草幼苗的子叶节为外植体；侵染及共培养：将外植体放入携带有目的基因的重组发根农杆菌Ar1193侵染液中浸泡，得到侵染后的外植体，吸干外植体表面的侵染液，将外植体置于MS固体培养基上暗培养；诱导及筛选：暗培养完成后，吸去表面液体残留，将外置体插入添加抗生素的诱导培养基中进行诱导及筛选，初步得到转基因毛状根；将转基因毛状根转移至继代培养基中继代培养。本方法毛状根诱导率达到96.7％，毛状根阳性率达100％；本发明建立的利用柱花草转基因毛状根制备原生质体的方法，获得的原生质体细胞100％为转基因细胞。

技术研发人员：刘攀道,孙昊,张建禹,赵兴坤
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29