一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用

本发明涉及酶催化，尤其涉及一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用。

背景技术：

1、甘油葡萄糖苷(glucosyl glycerol，gg)是一种由葡萄糖基和甘油通过糖苷键连接形成的糖苷类化合物，可以保护细胞免受高渗透压、高温、干旱以及紫外线等恶劣环境的破坏。2-o-α-甘油葡萄糖苷(2-o-α-gg)是gg的异构体之一，不仅具有优异的保湿性能，其甜度仅为蔗糖的55％。更重要的是，由于2-o-α-gg存在时人唾液中的口腔细菌因不会产生酸而表现出非致龋性，可作为潜在甜味剂应用于食品工业。同时，2-o-α-gg具有低吸水性、高保湿性的特点，可作为多用途的抗衰老、促细胞和皮肤保湿剂应用于化妆品行业，具有广阔的市场前景和需求。

2、相比较产率太低、副产物多的化学法，酶催化法合成2-o-α-gg具有反应速率快、底物特异性较强、反应条件温和且环保的优点。蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase，spase)是一种能够特异性转移葡萄糖苷键的酶，目前主要用于2-o-α-gg合成的生物催化剂，具有良好的特异性。然而，野生蔗糖磷酸化酶耐热性较差，受热易降解，难以满足工业催化过程中，需要通过高温提高反应速率、反应物的溶解度和减少微生物污染的要求，限制了其在大规模工业加工中的应用。

3、目前，酶的稳定性改造基本集中在定点诱变和合理设计方面，然而，当突变位点位于活性位点附近时，平衡酶的活性和耐热性是极具挑战性的。同时，合理的设计需要大量的迭代实验，这对于一些缺乏高通量筛选方法的酶来说是极其困难的。因此，需要开发一种无需广泛的结构知识或复杂实验筛选的方法来提升蔗糖磷酸化酶的耐热性和活性。

4、与常规线性蛋白质相比，环状蛋白质具有更高的热稳定性和结构稳定性。因此，选择一种合适的分子环化技术将spase线性酶转变为环化酶有望提高spase的热稳定性。spytag/spycatcher是一对反应速率快、反应过程无需特定催化酶、适用对象广的分子粘合剂，能够通过异肽键实现连接。因此，基于spytag/spycatcher等分子粘合剂实现spase自环化，有望提升spase的耐热性和2-o-α-gg的产率，实现2-o-α-gg大规模酶法制备，具有极高的工业利用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用，为2-o-α-gg的大规模酶法制备提供新的可行性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种环化蔗糖磷酸化酶，所述环化蔗糖磷酸化酶是通过下述linker1～8中的任意一种将如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键得到的；

4、linker 1：gsg；

5、linker 2：gsgsgsgsg；

6、linker 3：gsgsgsgsgsgs；

7、linker4：gslvprgsc；

8、linker 5：eaaakeaaak；

9、linker 6：gggggs；

10、linker 7：sssssg；

11、linker 8：ggggssss。

12、优选的，所述异肽键包括由如seq id no.2所示的spytag与如seq id no.3所示的spycatcher构成的异肽键、由如seq id no.4所示的snooptag与如seq id no.5所示的snoopcatcher构成的异肽键或由如seq id no.6所示的sdytag与如seq id no.7所示的sdycatcher构成的异肽键。

13、优选的，所述环化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.8～seq id no.17所示。

14、本发明提供了编码所述环化蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列。

15、本发明提供了包含所述核苷酸序列的表达载体。

16、本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞。

17、本发明还提供了所述的环化蔗糖磷酸化酶，或所述的核苷酸序列，或所述的表达载体，或所述的宿主细胞在生产2-o-α甘油葡萄糖苷中的应用。

18、本发明还进一步提供了一种生产2-o-α甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：

19、(1)培养所述的宿主细胞，然后破碎得到含有环化蔗糖磷酸化酶的酶液；

20、(2)将蔗糖、甘油溶于水后与所述含有环化蔗糖磷酸化酶的酶液混合，在30～50℃，ph 5.5～8.0条件下反应12～48h后得到2-o-α甘油葡萄糖苷。

21、优选的，蔗糖溶于水后的浓度为0.25～1.5mol/l，甘油溶于水后的浓度为0.3～1.6mol/l。

22、优选的，所述酶液中环化蔗糖磷酸化酶的终浓度为0.5～2mg/ml。

23、本发明通过linker在野生蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键，制备得到了一种酶活显著提高的环化蔗糖磷酸化酶，可在24h内将蔗糖快速转化，其在具有较高的催化活性的同时，还具有良好的温度稳定性，更适用于工业化生产，为2-o-α-gg大规模酶法制备提供了新的可行性。

技术特征：

1.一种环化蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述环化蔗糖磷酸化酶是通过下述linker 1～8中的任意一种将如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键得到的；

2.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述异肽键包括由如seq idno.2所示的spytag与如seq id no.3所示的spycatcher构成的异肽键、由如seq id no.4所示的snooptag与如seq id no.5所示的snoopcatcher构成的异肽键或由如seq id no.6所示的sdytag与如seq id no.7所示的sdycatcher构成的异肽键。

3.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述环化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.8～seq id no.17所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述环化蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列。

5.包含权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。

6.包含权利要求5所述表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1～3任一项所述的环化蔗糖磷酸化酶，或权利要求4所述的核苷酸序列，或权利要求5所述的表达载体，或权利要求6所述的宿主细胞在生产2-o-α甘油葡萄糖苷中的应用。

8.一种生产2-o-α甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，蔗糖溶于水后的浓度为0.25～1.5mol/l，甘油溶于水后的浓度为0.3～1.6mol/l。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酶液中环化蔗糖磷酸化酶的终浓度为0.5～2mg/ml。

技术总结
本发明提供了一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用，属于酶催化技术领域。所述环化蔗糖磷酸化酶通过下述linker中的任意一种将如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的N端和C端分别连接不同的异肽键得到；linker 1：GSG；linker 2：GSGSGSGSG；linker 3：GSGSGSGSGSGS；linker4：GSLVPRGSC；linker 5：EAAAKEAAAK；linker 6：GGGGGS；linker 7：SSSSSG；linker 8：GGGGSSSS。本发明制备的环化蔗糖磷酸化酶相比野生酶具有更高的催化活性和热稳定性，为2‑O‑α‑GG大规模酶法制备提供了新的可行性。

技术研发人员：梁浩,魏斌
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29