一种高纯度几丁寡糖的制备方法

本发明涉及海洋生物工程领域，特别涉及一种高纯度几丁寡糖的制备方法。

背景技术：

1、几丁质，又称甲壳素、甲壳质，是一种广泛存在于海洋甲壳动物外壳中的天然多糖。几丁寡糖，是几丁质的降解产物，是一种由n-乙酰-d氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成线性寡糖。几丁寡糖被报道具有多种生物活性，但是由于目前可获得的几丁寡糖纯度问题，以往研究报道中有关几丁寡糖的生物活性结果很难相互比较，甚至相互矛盾。比如，以往已有报道(carbohydrate polymers 174(2017)1138-1143)几丁寡糖具有很好的抗炎活性，但近期研究发现，几丁寡糖并不具有抗炎活性，其抗炎活性主要来源于几丁寡糖中的少量杂质o-乙酰化几丁寡糖。

2、目前，几丁寡糖主要两种方法获得：(1)通过几丁质为原料采用生物酶解技术获得，但目前发现的几丁质酶大都为外切酶，几丁质酶解产物主要为低聚合度的几丁二糖，其它几丁寡糖较少，同时由于天然几丁质原料本身的原因，不可避免几丁质原料中含有少量的氨基葡萄糖残基存在，因此几丁质降解产物中也可能存在少量的壳寡糖组分(一种由d-氨基葡萄糖和n-乙酰-d氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成复杂寡糖)。(2)以壳寡糖为原料通过化学法n-乙酰化反应制备含有多种聚合度分布的几丁寡糖，然而，化学法位点选择性较差，制备的几丁寡糖产物常伴有部分o-乙酰化几丁寡糖的产物。因此，无论生物酶解法还是化学n-乙酰化法，都很难获得高纯度的几丁寡糖产物，产物中部分的壳寡糖或者o-乙酰化几丁寡糖给几丁寡糖的结构鉴定与生物活性研究带来巨大的干扰。

3、因此，如何制备高纯度的几丁寡糖，精准认识几丁寡糖的生物学功能，是实现甲壳多糖生物资源高效利用的重要难题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种高纯度几丁寡糖的制备方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种高纯度几丁寡糖的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)将壳寡糖进行乙酰化反应后，得到n-乙酰化壳寡糖混合物；

5、(2)将所得n-乙酰化壳寡糖混合物溶解后，用离子交换色谱柱在ph为3-6下进行分离纯化，收集含有中性寡糖的洗脱液组分；

6、(3)将洗脱液浓缩，冷冻干燥后加入氨水，搅拌反应4-8h；

7、(4)用离子交换色谱柱在ph为3-6下进行分离纯化，冷冻干燥，即得高纯度几丁寡糖。

8、上述方案中，步骤(1)的具体方法如下：将壳寡糖加入到甲醇与水的混合液中；溶解后调整溶液ph>9，反应0.5-1h，后再加入乙酸酐在室温下反应1-4h，反应后收集反应液得到n-乙酰化壳寡糖混合物。

9、进一步的，所述壳寡糖与乙酸酐的质量体积比为1:0.1-1.5。

10、进一步的，所述甲醇与水的体积比为1:1。

11、上述的反应式如下：

12、

13、上述方案中，步骤(2)和(4)中的离子交换色谱柱为cm sephadex c-25或cmsepharose fast flow。

14、上述方案中，步骤(2)中，将所得n-乙酰化壳寡糖混合物水溶后用盐酸调ph至3-6，然后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再进行分离纯化。

15、上述方案中，步骤(2)中，以总糖含量检测的方法进行收集含有中性寡糖的洗脱液组分。

16、上述方案中，步骤(3)中，氨水的质量分数为5-25％。

17、上述方案中，步骤(3)中，干燥后的糖和氨水的质量体积比为1：0.2-0.5。

18、上述方案中，加入氨水反应后，调ph为3-6，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再进行分离纯化。

19、通过上述技术方案，本发明提供的一种高纯度几丁寡糖的制备方法具有如下有益效果：

20、本发明针对目前几丁寡糖制备过程中不可避免的壳寡糖或者o-乙酰化几丁寡糖污染物，分别通过离子交换色谱和酸碱度精准控制去除杂质，制备的几丁寡糖纯度达到99.5％以上，将具有重要的应用潜力。

21、本发明以壳寡糖原料，制备的几丁寡糖聚合度分布种均匀，包括几丁二糖至几丁六糖的多种寡糖，成本低，制备方法操作简便，重复性好，可用于进一步几丁寡糖的生物活性筛选以及单一聚合度几丁寡糖标准品的分离纯化，对于几丁寡糖类生物制品的开发及精准质量控制均具有重要意义。

技术特征：

1.一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法如下：将壳寡糖加入到甲醇与水的混合液中；溶解后调整溶液ph>9，反应0.5-1h，后再加入乙酸酐在室温下反应1-4h，反应后收集反应液得到n-乙酰化壳寡糖混合物。

3.根据权利要求2所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，所述壳寡糖与乙酸酐的质量体积比为1:0.1-1.5。

4.根据权利要求2所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，所述甲醇与水的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中的离子交换色谱柱为cm sephadex c-25或cm sepharose fast flow。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将所得n-乙酰化壳寡糖混合物水溶后用盐酸调ph至3-6，然后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再进行分离纯化。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以总糖含量检测的方法进行收集含有中性寡糖的洗脱液组分。

8.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，氨水的质量分数为5-25％。

9.根据权利要求1或8所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，干燥后的糖和氨水的质量体积比为1：0.2-0.5。

10.根据权利要求1所述的一种高纯度几丁寡糖的制备方法，其特征在于，加入氨水反应后，调ph为3-6，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再进行分离纯化。

技术总结
本发明公开了一种高纯度几丁寡糖的制备方法，包括如下步骤：将壳寡糖进行乙酰化反应后，得到N‑乙酰化壳寡糖混合物；将所得N‑乙酰化壳寡糖混合物溶解后，用离子交换色谱柱在pH为3‑6下进行分离纯化，收集含有中性寡糖的洗脱液组分；将洗脱液浓缩，冷冻干燥后加入氨水，搅拌反应4‑8h；用离子交换色谱柱在pH为3‑6下进行分离纯化，冷冻干燥，即得高纯度几丁寡糖。本发明所公开的方法可制得高纯度的几丁寡糖，成本低，制备方法操作简便，重复性好，可用于进一步几丁寡糖的生物活性筛选以及单一聚合度几丁寡糖标准品的分离纯化，对于几丁寡糖类生物制品的开发及精准质量控制均具有重要意义。

技术研发人员：李克成,葛香云,郝文桐,王昕,邢荣娥,刘松,秦玉坤,李鹏程
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/9