一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子检测，具体涉及一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用。

背景技术：

1、阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)是一种常见的肠道菌群中的细菌，属于疣微菌门(verrucomicrobia)。它是一种革兰氏阴性菌，以其对人类健康的积极影响而备受关注。它具有以下几个方面的功能和益处：1)黏液屏障维护；2)调节营养物质代谢；3)免疫调节及4)代谢调节。因此，阿克曼菌已成为下一代益生菌研究开发的热点。

2、广西阿克曼菌(a.guangxiensis)是最近报道的一种新型阿克曼菌，同时cn116200312a专利公开了两种广西阿克曼菌菌株，分别为广西阿克曼氏菌菌株n21116和n21169，保藏编号分别为：gdmccno:62888和gdmccno:62889。

3、由于阿克曼菌为厌氧微生物，其培养过程中很容易因氧分控制不当造成污染。尤其在大规模发酵生产中，此类污染会造成严重的经济损失。广西阿克曼菌的不同菌株具有较大的益生特性差异，一旦混用将导致菌体产品无法达到预期的健康效益。然而目前缺乏一种在广西阿克曼菌菌株水平的鉴定方案。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物，能够快速准确区分广西阿克曼氏菌菌株n21116和n2116，为菌种株水平的鉴定和污染控制提供了新手段。

2、本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括广西阿克曼菌菌株n21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株n21169检测引物对；

3、所述广西阿克曼菌菌株n21116检测引物对包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物；

4、所述广西阿克曼菌菌株n21169检测引物对包括核苷酸序列如seq id no:11所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的反向引物。

5、本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒，包括所述引物和其它pcr检测试剂。

6、优选的，所述其它pcr检测试剂包括2×pcr预混液。

7、优选的，所述试剂盒还包括dna提取试剂和dna分子标准品。

8、优选的，所述dna分子标准品包括广西阿克曼菌菌株n21116的dna分子标准品和广西阿克曼菌菌株n21169的dna分子标准品；

9、所述广西阿克曼菌菌株n21116的dna分子标准品的核苷酸序列如seq id no:21所示；

10、所述广西阿克曼菌菌株n21169的dna分子标准品的核苷酸序列如seq id no:22所示。

11、本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒中的应用。

12、优选的，所述广西阿克曼菌菌株包括n21169和/或n21169。

13、本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测试剂盒中的应用。

14、优选的，污染排查中污染微生物包括以下至少一项：厚壁菌门、放线菌门、变形菌、拟杆菌和非目标广西阿克曼菌菌株。

15、本发明提供了一种广西阿克曼菌株污染排查检测试剂盒，包括所述引物或所述试剂盒和污染微生物检测引物；

16、所述污染微生物检测引物包括拟杆菌检测引物、厚壁菌门检测引物、放线菌门检测引物、alpha变形菌门检测引物、gamma变形菌门检测引物。

17、本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括广西阿克曼菌菌株n21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株n21169检测引物对；所述广西阿克曼菌菌株n21116检测引物对包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq idno:2所示的反向引物；所述广西阿克曼菌菌株n21169检测引物对包括核苷酸序列如seq idno:11所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的反向引物。本发明从基因数据库中下载目标检测菌株、实验室以及发酵车间污染微生物的基因组，以引物能够特异性扩增目标生物类群而不能扩增污染微生物的原则设计引物，针对目标检测菌株分别设计了5对引物，通过实验验证，针对广西阿克曼菌菌株n21116得到4对能够扩增得到目标片段的引物对，针对广西阿克曼菌菌株n21169得到3对能够扩增得到目标片段的引物，对筛选得到的引物进一步进行灵敏度检测，结果表明，与其他检测引物相比，agun21116_1和agun21169_1引物对于本物种来说均呈现阳性条带更清晰明亮，具有良好的灵敏度，其中agun21116_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组dna，agun21169_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组dna。同时本发明还对引物进行特异性检测，结果表明，agun21116_1和agun21169_1引物仅能对对应广西阿克曼菌菌株实现条带的扩增，而对其他种类的阿克曼菌的检测均未扩增到任何条带。因此，agun21116_1和agun21169_1可作为两种广西阿克曼菌的特异性引物，可应用在株型鉴定和污染排查方面。

技术特征：

1.一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，其特征在于，包括广西阿克曼菌菌株n21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株n21169检测引物对；

2.一种广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和其它pcr检测试剂。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述其它pcr检测试剂包括2×pcr预混液。

4.根据权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna提取试剂和dna分子标准品。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述dna分子标准品包括广西阿克曼菌菌株n21116的dna分子标准品和广西阿克曼菌菌株n21169的dna分子标准品；

6.权利要求1所述引物在制备广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述广西阿克曼菌菌株包括n21116和/或n21169。

8.权利要求1所述引物在制备广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，污染排查中污染微生物包括以下至少一项：厚壁菌门、放线菌门、变形菌、拟杆菌和非目标广西阿克曼菌菌株。

10.一种广西阿克曼菌株污染排查检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物或权利要求2～5任意一项所述试剂盒和污染微生物检测引物；

技术总结
本发明提供了一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO:11和12所示的广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对。所述引物具有检测特异性强、灵敏度、检测方便快速的特点，可作为两种广西阿克曼菌的特异性引物，可应用在株型鉴定和污染排查方面。

技术研发人员：芦志龙,唐琴艳,黄诗婷,罗卫飞,梁艳
受保护的技术使用者：广西爱生生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7