四聚体抗体复合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物分离纯化，具体涉及四聚体抗体复合物及其应用。

背景技术：

1、随着细胞治疗和基因治疗（cgt）技术的不断发展，细胞的改造、体外扩增培养等相关研究已经逐渐成为生命科学领域中的研究热点，而对这些细胞深入研究，就需要对特定目标细胞进行分离纯化，获得较纯的目的细胞，因此，细胞的分选已成为相关研究的一个重要环节。

2、目前，基于免疫识别特性的细胞分选方法包括荧光激活细胞分选方法（facs）和磁性激活细胞分选法（macs）。facs是利用流式细胞仪分选细胞，虽被认为是细胞分选的“金标准”，但是它所需设备比较昂贵，耗时，且需要高水平的技术支持以及专业的操作人员；同时，由于facs对细胞刺激较大，因此对分选出的细胞活性有较大影响；另一方面，facs分选细胞的通量较低，无法实现多个样本的细胞分选，且通常一次性难以获得足够的细胞，仅适合小规模的研究工作。磁性细胞分选（macs）用结合有抗体的免疫磁珠与样品细胞进行孵育通过磁分离纯化细胞。与facs相比，macs法是一种将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的细胞分选技术，该分选技术高效方便，无需特殊设备，操作简单，对操作人员的技术要求也不高。而且基本可以忽略对细胞的影响，分离得到的细胞具有较高的复苏率及细胞活性，对于下游应用影响较小，在保持细胞活性方面优于流式分选，因此具有非常大的应用前景。

3、现有的磁性激活细胞分选方法中，stem cell公司通过抗体四聚体（tac）的方式标记磁珠来实现细胞分离，解决了传统化学连接偶联方式的一些弊端，如：1、会破坏抗体的活性，不能保证抗体的空间取向；2、抗体偶联效率低，且易失效，不易存储。该方法中的tac是由两个小鼠的igg1抗体和两个大鼠抗小鼠的igg1组成。两个大鼠抗小鼠的igg1将两个小鼠抗体联起来，其中一个小鼠抗体与需要的细胞特异结合，而另一个小鼠抗体与磁珠上包被的葡聚糖结合（如图1所示）。当需要的细胞与磁珠结合后，在通过放在磁极上的柱子时，需要的细胞被留在柱子上，不需要的细胞会通过柱子。将留在柱子上的细胞收集起来即可进行后续的研究。但该方法在形成tac抗体复合物的过程中只有约30%左右的概率形成如图所示结构的复合物（a-b-c），另外还可以形成a-b-a和c-b-c的无效四聚体复合物，从而导致偶联效率降低，大大降低抗体利用率。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供四聚体抗体复合物（tac）及其应用。

2、本发明提供了四聚体抗体复合物，包括四个抗体，其中抗体a和抗体c通过一个双特异性抗体b连接，双特异性抗体b是分别来自不同抗体的f(ab')2区彼此连接；

3、所述双特异性抗体b的两个f(ab')2区，分别靶向抗体a的fc区和抗体c的fc区；

4、所述抗体a靶向待测靶标，所述抗体c靶向固相载体，且抗体a的fc区与抗体c的fc区来源于不同物种。

5、进一步的，

6、所述抗体a靶向的待测靶标为细胞表面抗原；

7、所述抗体c靶向的固相载体为磁珠、微球、玻片或芯片，所述固相载体表面修饰有葡聚糖和/或糊精。

8、更进一步的，本发明所述的四聚体抗体复合物中，所述细胞表面抗原包括但不限于cd3、cd4、cd8、cd16、cd19、cd45、cd56、cd138中的至少一种。

9、更进一步的，本发明所述的四聚体抗体复合物中，所述双特异性抗体b不含有fc区；所述抗体a的fc区与抗体c的fc区独立地选自羊、鼠、兔、马、猪或驴的fc区。

10、一些实施例中，

11、所述抗体a特异性识别cd3、cd4、cd8、cd16、cd19、cd45、cd56、cd138中的至少一种；

12、所述抗体c特异性识别葡聚糖；

13、所述双特异性抗体b不含有fc区域，且其中一边f(ab')2特异性识别抗体a的fc区，另一边f(ab')2特异性识别抗体c的fc区；

14、其中，双特异性抗体b是由抗两个不同物种抗体的fc端的f(ab')2彼此偶联形成的。一些实施例中，所述双特异性抗体b由抗两个不同物种抗体的fc端的f(ab')2通过pdm偶联。所述抗两个不同物种抗体选自：羊抗鼠、羊抗兔、羊抗人、羊抗猴中任意两种，或者选自：鼠抗羊、鼠抗兔、鼠抗人、鼠抗猴中任意两种，或者选自兔抗羊、兔抗人、兔抗猴、兔抗鼠中的任意两种。

15、一些具体实施例中，

16、所述抗体a为鼠抗人cd3抗体、鼠抗人cd4抗体或鼠抗人cd8抗体；

17、所述抗体c为兔抗葡聚糖抗体；

18、所述双特异性抗体b由山羊f(ab')2抗小鼠igg fc和山羊f(ab')2抗兔igg fc制得。

19、本发明提供了一种新的四聚体抗体复合物，其包括一分子的双特异性抗体和与此双特异性抗体特异结合的抗体a和抗体c，这种结合方式成功的避免了现有技术中四聚体抗体复合物无效产物高的问题，大大提高了四聚体抗体复合物的纯度和产率，降低了四聚体抗体复合物合成的成本。

20、本发明提供了所述的四聚体抗体复合物的制备方法，其包括利用化学偶联方法获得双特异性抗体b，并与抗体a和抗体c混合，经孵育制成所述四聚体抗体复合物

21、进一步的，本发明所述的制备方法中，

22、所述双特异性抗体b、抗体a和抗体c的摩尔比为1：1：1；

23、所述混合的时间为5~30min。

24、本发明提供了偶联物，其包括本发明所述的四聚体抗体复合物和固相载体。

25、进一步的，所述固相载体为葡聚糖修饰的磁珠，其直径为50nm~5μm。

26、本发明提供了所述的四聚体抗体复合物、所述的制备方法制得的四聚体抗体复合物或所述的偶联物在细胞分离纯化中的应用。

27、本发明还提供了细胞分离纯化的试剂，其包括所述的四聚体抗体复合物、所述的制备方法制得的四聚体抗体复合物或所述的偶联物在细胞。

28、所述试剂中还包括缓冲液，所述缓冲液包括但不限于pbs缓冲液、hepes缓冲液、tbe缓冲液、tris缓冲液、tae缓冲液或碳酸盐缓冲液。

29、本发明提供了细胞分离纯化的方法，其包括利用本发明所述的四聚体抗体复合物、本发明所述的制备方法制得的四聚体抗体复合物或本发明所述的偶联物将样品中目的细胞的分离。

30、进一步的，所述样品包括组织样本、全血、pbmc等。

31、本发明提供一种双抗，使得该双抗分子的fab段分别抗不同的两个抗体分子，或者抗同一种属抗体fc段的不同部位，从实现由四个抗体组成的特异性四聚体将磁珠与目标细胞连接，达到细胞分选的目的。该双特异性抗抗体可以与另外两种抗体形成单一四聚体产物，有效地避免了四聚体无效产物的产生，大大提高了抗体的利用效率，降低了抗体的使用成本。

32、

技术特征：

1.四聚体抗体复合物，其特征在于，包括四个抗体，其中抗体a和抗体c通过一个双特异性抗体b彼此连接；

2.根据权利要求1所述的四聚体抗体复合物，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的四聚体抗体复合物，其特征在于，所述细胞表面抗原包括为cd3、cd4、cd8、cd16、cd19、cd45、cd56、cd138中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的四聚体抗体复合物，其特征在于，所述双特异性抗体b不含有fc区；所述抗体a的fc区与抗体c的fc区独立地选自羊、鼠、兔、马、猪或驴的fc区。

5.根据权利要求1~4任一项所述的四聚体抗体复合物，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的四聚体抗体复合物，其特征在于，

7.权利要求1~6任一项所述的的四聚体抗体复合物的制备方法，包括利用化学偶联方法获得双特异性抗体b，并与抗体a和抗体c混合，经孵育制成所述四聚体抗体复合物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

9.偶联物，其特征在于，包括权利要求1~6任一项所述的四聚体抗体复合物和固相载体。

10.根据权利要求9所述的偶联物，其特征在于，所述固相载体为葡聚糖修饰的磁珠，其直径为50nm~5μm。

11.权利要求1~6任一项所述的四聚体抗体复合物在细胞分离纯化中的应用。

12.权利要求9或10所述的偶联物在细胞分离纯化中的应用。

13.细胞分离纯化的试剂，其包括权利要求1~6任一项所述的四聚体抗体复合物。

14.细胞分离纯化的试剂，其包括权利要求9或10所述的偶联物。

15.细胞分离纯化的方法，其特征在于，包括采用权利要求13或14所述的试剂将样品中目的细胞的分离。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述样品包括组织样本、全血或pbmc。

技术总结
本发明涉及生物诊断技术领域，具体涉及四聚体抗体复合物及其应用。本发明提供一种双抗，使得该双抗分子的Fab段分别抗不同的两个抗体分子，或者抗同一种属抗体Fc段的不同部位，从实现由四个抗体组成的特异性四聚体将磁珠与目标细胞连接，达到细胞分选的目的。该特异性双抗抗体可以与另外两种抗体形成单一四聚体产物，有效地避免了四聚体无效产物的产生，大大提高了抗体的利用效率，降低了抗体的使用成本。

技术研发人员：董友玉,任磊,李林,苏思雨,刘亚男,尤娟,胡建汇,姚天宇
受保护的技术使用者：山东微领生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11