一种细胞培养用温敏微载体及其制备方法以及培养细胞的方法与流程

本发明属于生化工程领域，特别涉及一种细胞培养用温敏微载体及其制备方法以及培养细胞的方法。

背景技术：

1、微载体是指粒径为100～300μm，用于细胞黏附生长的基质。制备微载体的材料来源主要包括两大类合成高分子材料和天然聚合物及其衍生物。与二维细胞培养相比，微载体具有更高的比表面积，易用于大规模的细胞生产，获取多种生物制品，如疫苗、抗体、重组蛋白等。

2、传统的细胞收获方法，如酶水解和机械刮削法，会对膜蛋白和细胞功能有害，导致细胞活力的降低(参见majd h,wipff pj,buscemi l,et al.a novel method of dynamicculture surface expansion improves mesenchymal stem cell proliferation andphenotype.stem cells,2009,27,200–209.)。为了获取更高质量的细胞，通常采用非酶和非机械方法从培养基中回收细胞。因此，温度响应性微载体的开发有望取代传统的收获方法。使用温敏方法收获细胞是基于细胞生长表面亲/疏水性变化，实现细胞温和无损的脱落，提高了细胞的质量。

3、然而，理论上，利用温敏材料的亲疏水温度响应性可实现细胞脱附，但是实际应用中，并不是任意的温敏材料结合到基体微球后都能较好的实现细胞粘附和脱附，并不能达到理想的实际应用效果。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种细胞培养用温敏微载体及其制备方法，以及培养细胞的方法。本发明提供的细胞培养用温敏微载体能够实现对不同细胞的温敏性贴附和脱附，达到对细胞附着和分离的精确而温和的控制，有利于大规模无损伤获取细胞。

2、本发明提供了一种细胞培养用温敏微载体，包括：玻璃微球和接枝在所述玻璃微球表面的聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)；所述聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)的结构如式(h)所示：

3、

4、代表玻璃微球；

5、n1、n2、n3为聚合度，其中，n1为200～5000，n2为10000～70000，n3为10000～70000。

6、优选的，所述玻璃微球的粒径为180～250μm。

7、优选的，所述聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)在所述细胞培养用温敏微载体中的质量分数为0.2％～1.1％。

8、本发明还提供了一种上述技术方案中所述的细胞培养用温敏微载体的制备方法，包括以下步骤：

9、a)对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球；

10、b)将步骤a)所得氨基化玻璃微球与式(1)所示丙炔醇改性的谷氨酸-n-羧基内酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；

11、c)将步骤b)所得表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与式(2)所示巯基改性的聚(n-异丙基丙烯酰胺)进行巯基-烯烃点击反应，得到细胞培养用温敏微载体；

12、

13、优选的，步骤a)中，所述氨基硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

14、优选的，步骤b)中，步骤a)所得氨基化玻璃微球与式(1)所示丙炔醇改性的谷氨酸-n-羧基内酸酐的质量比值为(0.5～2):1；

15、步骤b)中反应的温度为15～45℃，时间为1～5天。

16、优选的，步骤c)中，步骤b)所得表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与式(2)所示巯基改性的聚(n-异丙基丙烯酰胺)的质量比值为(0.5～2):1。

17、优选的，步骤c)中，所述点击反应在光引发剂的作用下进行；

18、所述光引发剂为irgacure 2959、irgacure 184和irgacure 907中的至少一种。

19、优选的，步骤c)中，所述点击反应在紫外照射下进行；

20、所述紫外照射的时间为1～4小时。

21、本发明还提供了一种培养细胞的方法，其中采用的培养载体为上述技术方案中所述的细胞培养用温敏微载体或上述技术方案中所述的制备方法制得的细胞培养用温敏微载体。

22、本发明提供的细胞培养用温敏微载体的制备方法，先对玻璃微球进行表面羟基活化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后与式(1)所示丙炔醇改性的谷氨酸-n-羧基内酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球，最后与式(2)所示巯基改性的聚(n-异丙基丙烯酰胺)进行巯基-烯烃点击反应，得到细胞培养用温敏微载体。本发明制得的细胞培养用温敏微载体，以聚谷氨酸作为表面聚合物的骨架，接枝式(2)所示巯基改性的聚(n-异丙基丙烯酰胺)，所制备的温敏微载体表面接枝化合物分布均匀，生物相容性好，利于细胞的快速贴附和扩增；且制成的微载体具有温敏性，通过控制温度，能够实现室温温和脱落细胞，有利于大规模无损伤获取细胞。总之，本发明所提供的细胞培养用温敏微载体，具有生物相容性好，利于细胞增殖等优点；在细胞分离时，通过降低培养温度，能够实现细胞的脱附，避免使用胰酶消化或其他手段分离细胞，降低了对细胞的损伤，有利于大规模无损伤获取细胞。

23、试验结果表明，本发明制备的温敏玻璃微球载体，可成功粘附细胞，同时可使细胞脱附率达到67％以上，表现出高效的细胞脱附性。

技术特征：

1.一种细胞培养用温敏微载体，其特征在于，包括：玻璃微球和接枝在所述玻璃微球表面的聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)；所述聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)的结构如式(h)所示：

2.根据权利要求1所述的细胞培养用温敏微载体，其特征在于，所述玻璃微球的粒径为180～250μm。

3.根据权利要求1所述的细胞培养用温敏微载体，其特征在于，所述聚丙炔基谷氨酸-g-聚(n-异丙基丙烯酰胺)在所述细胞培养用温敏微载体中的质量分数为0.2％～1.1％。

4.一种权利要求1～3中任一项所述的细胞培养用温敏微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中，所述氨基硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，步骤a)所得氨基化玻璃微球与式(1)所示丙炔醇改性的谷氨酸-n-羧基内酸酐的质量比值为(0.5～2):1；

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，步骤b)所得表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与式(2)所示巯基改性的聚(n-异丙基丙烯酰胺)的质量比值为(0.5～2):1。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述点击反应在光引发剂的作用下进行；

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述点击反应在紫外照射下进行；

10.一种培养细胞的方法，其特征在于，其中采用的培养载体为权利要求1～3中任一项所述的细胞培养用温敏微载体或权利要求4～9中任一项所述的制备方法制得的细胞培养用温敏微载体。

技术总结
本发明提供了一种细胞培养用温敏微载体及其制备方法以及培养细胞的方法。本发明提供的制备方法，先对玻璃微球进行表面羟基活化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后与式(1)所示丙炔醇改性的谷氨酸‑N‑羧基内酸酐进行反应，最后与式(2)所示巯基改性的聚(N‑异丙基丙烯酰胺)进行巯基‑烯烃点击反应，得到细胞培养用温敏微载体。本发明制得的细胞培养用温敏微载体，以聚谷氨酸作为表面聚合物的骨架，接枝式(2)所示巯基改性的聚(N‑异丙基丙烯酰胺)，所得温敏微载体表面接枝化合物分布均匀，生物相容性好，利于细胞的快速贴附和扩增；且其具有温敏性，通过控制温度能够实现室温温和脱落细胞，有利于大规模无损伤获取细胞。

技术研发人员：田华雨,罗智敏,郝凯
受保护的技术使用者：嘉庚创新实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10