一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用

本发明涉及工业微生物，特别涉及一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid，3-hb)是一种具有广泛应用潜力的重要化学品，能够参与可生物降解塑料的合成，作为生物降解塑料聚3-羟基丁酸(phb)的单体，通过微生物发酵或化学合成方法制备phb。phb具有良好的生物降解性和生物相容性，可用于包装材料、医疗器械、农业覆盖物等，还可以和其他生物聚合物共聚，以改善其物理性质，如聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-6-羟基己酸酯)等。

2、3-hb单体通过聚合形成phb后，可用于多方面应用，尤其是环保方面。随着环保要求提高，在包装领域生物可降解材料越来越受到关注，正在逐步取代传统不可降解塑料。聚羟基丁酸酯的物理性能，机械性能与聚丙烯类似，并且具有可生物降解性，在自然界中降解产物为二氧化碳和水，对环境无污染，故在包装领域有广泛应用前景。因此，研究开发利用高效生产3-hb的方法对于推动生物基化学品的发展，减少对有限资源的依赖以及减少环境影响具有重要意义。近年来，利用生物法合成3-hb的方法受到了广泛关注。但目前3-hb的生产面临一个主要问题：中间产物乙酸的产量较大，导致流向3-hb的量大大减少，从而降低了生产效率，成为制约3-hb生产的最大挑战。因此，亟需一种能够提高3-hb产量的方法，以提高工业生产的效率，降低生产成本。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。

2、本发明提供了一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，包括如下步骤：

3、s1：体外扩增phaa、phab、tesb基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；所述tesb的核苷酸序列如seq id no.63所示。

4、s2：将s1所述质粒导入菌株中。

5、进一步的，步骤s2所述菌株为escherichia coli nissle 1917、escherichiacoli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseri atcc 33323和bacilluscoagulans dsm1中的任意一种。

6、本申请中使用的halomonas sp.ly03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：63382。菌株名称为halomonas sp.ly03，分类命名为halomonas sp.。

7、进一步的，步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种；所述phaatd的核苷酸序列如seq idno.61所示，所述phaare核苷酸序列如seq id no.64所示；

8、进一步的，步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。所述phabtd的核苷酸序列如seq idno.62所示，所述phabre的核苷酸序列如seq id no.65所示；

9、进一步的，步骤s1所述单一片段为tesb-phaatd-phabtd、tesb-phaare-phabtd、tesb-phaare-phabre、tesb-phabtd-phaatd、phaatd-tesb-phabtd、phabtd-tesb-phaatd、phaatd-phabtd-tesb、phabtd-phaatd-tesb中的任意一种，优选为phaatd-tesb-phabtd。

10、所述tesb-phaatd-phabtd的核苷酸序列如seq id no.53所示；所述tesb-phaare-phabtd的核苷酸序列如seq id no.54所示；所述tesb-phaare-phabre的核苷酸序列如seq idno.55所示；所述tesb-phabtd-phaatd的核苷酸序列如seq id no.56所示；所述phaatd-tesb-phabtd的核苷酸序列如seq id no.57所示；所述phabtd-tesb-phaatd的核苷酸序列如seq idno.58所示；所述phaatd-phabtd-tesb的核苷酸序列如seq id no.59所示；所述phabtd-phaatd-tesb的核苷酸序列如seq id no.60所示；

11、本发明还提供一种生产3-羟基丁酸的菌株，由所述的构建方法得到。

12、本发明还提供一种使用所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。

13、进一步的，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。

14、进一步的，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/l。

15、进一步的，所述发酵的温度为36～42℃，ph为6～11，发酵的时间为12～48h。

16、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

17、(1)本发明构建的联合代谢途径菌株，提高了3-hb的产量。

18、(2)本发明对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物，减少了中间代谢产物乙酸对细菌3-hb产量的影响，进一步提高了3-hb的产量。

19、(3)本发明利用工程菌发酵生产3-hb，生产工艺简单、生产效率高，适用于工业化连续性生产。

技术特征：

1.一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2所述菌株为escherichia colinissle 1917、escherichia coli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseriatcc 33323和bacillus coagulans dsm1中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1所述单一片段为tesb-phaatd-phabtd、tesb-phaare-phabtd、tesb-phaare-phabre、tesb-phabtd-phaatd、phaatd-tesb-phabtd、phabtd-tesb-phaatd、phaatd-phabtd-tesb、phabtd-phaatd-tesb中的任意一种。

6.一种生产3-羟基丁酸的菌株，其特征在于，由权利要求1～5任一项所述的构建方法得到。

7.一种使用权利要求6所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/l。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为36～42℃，发酵的ph为6～11，发酵的时间为12～48h。

技术总结
本发明公开了一种生产3‑羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增phaA、phaB、tesB基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；S2：将S1所述质粒导入菌株中。本发明利用工程菌发酵生产3‑HB，通过对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物，减少了中间代谢产物乙酸对细菌3‑HB产量的影响，进一步提高了3‑HB的产量。生产工艺简单、生产效率高，适用于工业化连续性生产。

技术研发人员：叶健文,杨富荏,林艺娜,王俊
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8