一种荧光素酶标记猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用

本发明为申请号为2021103693721,发明名称为一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用，申请日为2021年4月6日的发明的分案申请。本发明涉及基因工程，尤其涉及一种荧光素酶标记猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs virus,prrsv)引起的一种高度接触性传染病，临床上主要以妊娠母猪的流产、早产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，以及各生产阶段猪的呼吸道疾病为特征，该病的暴发严重影响养猪生产经济效益。特别是2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic prrsv,hp-prrsv)的出现和广泛流行，引发严重型prrs(atypical prrs)，临床上以高热、高发病率和高死亡率为特征，给养猪业造成了重大经济损失。自2013年以来，从北美传入的类nadc30毒株，已在田间广泛流行，逐渐成为田间主流毒株，且研究表明当前商品化疫苗与类nadc30缘关系较远，交叉保护效果不理想，且其与田间毒株的重组加剧了我国prrsv毒株的多样性和复杂性，极大的增加了养猪生产中prrs的防控难度。因此，了解猪繁殖与呼吸综合病毒的生物学特性，寻求抵抗病毒入侵、复制和增殖的策略是我们亟需解决的问题。

2、构建携带荧光报告基因的标签病毒一直是研究病毒的生命周期、定量其复制增殖水平的重要手段。但是大多数荧光蛋白或荧光素酶由于分子量大等原因，插入到病毒基因组容易引发致死性突变，即使成功拯救，病毒的复制增殖也容易受到影响，且荧光标签在传代的过程中容易丢失。

3、目前，还没有构建基于nanoluc互补荧光素酶报告系统(nanobit)的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的相关报道。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在问题，本发明提供一种荧光素酶标记猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。本发明将hibit序列引入猪繁殖与呼吸综合征病毒中得到一种具有荧光酶特性，同时可以正常增殖的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，通过该重组病毒可以准确快速地实现病毒的定量检测和抗病毒药物的筛选。

2、第一方面，本发明提供一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有hibit序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒。

3、进一步地，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在nsp2基因编码区的12-22aa、338-348aa、419-429aa位点中任一个位点，或在orf7羧基端含有hibit序列。

4、进一步地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征jxwn06毒株。

5、进一步地，所述hibit序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。

6、第二方面，本发明提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，包括：

7、构建猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒；

8、将所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒导入细胞中进行病毒拯救；

9、所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒为包括hibit序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列。

10、进一步地，所述包括hibit序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列为：

11、在nsp2基因编码区的12-22aa、338-348aa、419-429aa位点中任一个位点，或在orf7羧基端包括hibit序列的，猪繁殖与呼吸综合征重组病毒序列。

12、进一步地，所述细胞为marc-145、3d4/21、bhk-21、pk-15或vero中的一种或多种。

13、本发明进一步提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。

14、本发明进一步提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗病毒药物筛选中的应用。

15、本发明进一步提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度中的应用。

16、本发明进一步提供remdesivir在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

17、进一步地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。

18、本发明具备如下有益效果：

19、本发明通过在猪繁殖与呼吸综合征病毒的序列中插入hibit序列，制备得到具有荧光酶特性，同时增殖能力可以和野生病毒相近的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。该重组猪繁殖与呼吸综合征病毒具有良好的遗传稳定性，细胞中连续传代8次，荧光信号依然稳定，而且经验证其hibit标签未发生丢失、突变。本发明提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的tcid50和荧光强度呈良好的正相关，可以用于定量检测病毒滴度和抗病毒药物的筛选。

技术特征：

1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有hibit序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒；

2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征jxwn06毒株。

3.根据权利要求1或2所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述hibit序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。

4.权利要求1-3任一项所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，其特征在于，包括：

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述包括hibit序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列为：

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。

7.权利要求1-3任一项所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，或权利要求6述试剂盒在抗病毒药物筛选中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，或权利要求6述试剂盒在定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度中应用。

9.remdesivir在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种荧光素酶标记猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒。本发明通过将HiBiT序列插入猪繁殖与呼吸综合征病毒的序列中，构建得到了一种具有荧光酶特性，同时可以正常增殖的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。该重组猪繁殖与呼吸综合征病毒具备较好的遗传稳定性，通过该重组病毒可以准确快速地实现病毒的定量检测和抗病毒药物的筛选。

技术研发人员：周磊,王扬,杨汉春,盖新娜,张永宁,韩军,郭鑫
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10