一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段。

背景技术：

1、作为与糖基化磷脂酰肌醇连接的跨膜单链糖蛋白，叶酸受体与叶酸具有很高的亲和力，可以在细胞膜上通过内吞作用实现叶酸的转运，转运完成后的叶酸受体被内化，然后再循环回细胞膜继续参与转运。叶酸受体共有三种亚型，分别是叶酸受体α（folatereceptor α，folr1，fr α）、叶酸受体β（folate receptor β，folr2）和叶酸受体γ（folatereceptor γ，folr3）。正常细胞中，叶酸受体α的表达高度受限，而在卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌细胞膜上则具有很高的表达性。因此，叶酸受体α可以作为理想的卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌标记物并用以抗体偶联药物研发。

2、抗体偶联药物（adc）是一种利用单克隆抗体的特异性，通过识别癌细胞靶抗原，传递细胞毒性药物的新型治疗手段。其不仅可实现药物精准传递，将正常组织的毒性最小化，而且可扩大治疗窗口，增强药代动力学和药效学特性。在adc中，抗体需要具有高特异性、低免疫原性、半衰期长、稳定性好等特点，是决定药物疗效的关键因素。

3、基于以上思考，本发明认为人源化叶酸受体α抗体偶联卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌细胞治疗药物的前提在于如何保证特异性地识别具有叶酸受体α膜表达的卵巢癌肿瘤细胞。为克服该问题，本发明利用抗体表达与筛选技术，经历了免疫应答、抗体分选、基因重组、高通量表达与性能评估，筛选出灵敏度最高，特异性最强的叶酸受体α抗体，并将其用于卵巢癌和子宫内膜癌人源化叶酸受体α抗体偶联细胞治疗药物的叶酸受体α伴随诊断试剂盒抗体开发。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，通过以体外构建的叶酸受体α蛋白作为免疫原进行大白兔免疫，经细胞融合与筛选、获得表达抗体的杂交瘤细胞株。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，包含seq id no.7所示重链可变区氨基酸序列中的3个cdr和seq id no:8所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个cdr；或者，与上述轻重链cdr区具有单个或者多个cdr不超过每个cdr区3个氨基酸保守性变化的变体。

4、进一步的，当按照kabat编码规则对抗体hcdrs编码时，抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3；hcdr1氨基酸序列如seq id no:1所示，hcdr2氨基酸序列如seq id no:2所示，hcdr3氨基酸序列如seq id no:3所示，lcdr1氨基酸序列如seq id no:4所示，lcdr2氨基酸序列如seq id no:5所示，lcdr3氨基酸序列如seq id no:6所示；或者，与上述6个cdr区具有单个或者多个cdr不超过每个cdr区3个氨基酸保守性变化的变体。

5、优选地，前述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：

6、重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，或与seq id no:7 具有至少75％、85％、95％或99％序列同一性；

7、轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示，或与seq id no:8 具有至少75％、85％、95％或99％序列同一性。

8、优选地，前述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如seq id no:9所示的重链恒定区和氨基酸序列如seq id no:10所示的轻链恒定区。

9、优选地，前述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、fab、fab'、f（ab'）2、fv、scfv和dsfv。

10、上述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列如表1所示：

11、表1 引物和探针的氨基酸序列表

12、

13、一种核酸分子，核酸分子编码如前述抗体或抗原结合片段。核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体的核酸分子。

14、本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

15、一种重组载体，载体包含前述核酸分子。重组载体可通过本领域常规方法获得，即：将本申请核酸分子连接于各种载体上构建而成。载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。

16、一种重组宿主细胞，宿主细胞包含前述核酸分子或前述载体。宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组载体稳定地自行复制，且所携带的核酸可被有效表达即可。

17、一种用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒，包含前述抗体或其抗原结合片段。试剂盒可辅助临床医生筛选适用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的癌症患者，精准用药，避免无效治疗。

18、前述抗体或抗原结合片段在制备卵巢癌和子宫内膜癌靶向药物治疗前配套的叶酸受体α伴随诊断免疫组化检测产品中的应用。其中，检测包括定量、免疫原性检测、流式检测、elisa检测或ihc检测。

19、前述抗体或抗原结合片段在肿瘤的诊断或伴随诊断中的应用，或在制备肿瘤的诊断或伴随诊断试剂盒中的应用。

20、前述抗体或抗原结合片段在制备用叶酸受体α的临床前及临床检测试剂的应用。

21、一种非诊断目的的检测叶酸受体α表达的方法，采用前述抗体或抗原结合片段，或前述免疫组化抗体试剂或试剂盒，检测离体生物样本。

22、本发明的有益之处在于：本发明中的抗体或抗原结合片段能够特异性识别叶酸受体α抗原识别位点，可提供一种特异性强、灵敏度高、且免疫组化背景染色更低的检测叶酸受体α蛋白的免疫组化抗体；抗体可广泛用于体外检测叶酸受体α蛋白，制备卵巢癌和子宫内膜癌患者使用抗体偶联靶向药物治疗前配套的叶酸受体α蛋白伴随诊断免疫组化检测产品；且对于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒具有辅助精准用药作用，避免无效治疗。

技术特征：

1.一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3；所述hcdr1氨基酸序列如seq id no:1所示，所述hcdr2氨基酸序列如seq id no:2所示，所述hcdr3氨基酸序列如seq id no:3所示，所述lcdr1氨基酸序列如seq id no:4所示，所述lcdr2氨基酸序列如seq id no:5所示，所述lcdr3氨基酸序列如seq id no:6所示。

2.根据权利要求1所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如seq id no:7所示的重链可变区和氨基酸序列如seq id no:8所示的轻链可变区。

3.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如seq id no:9所示的重链恒定区和氨基酸序列如seq id no:10所示的轻链恒定区。

4.根据权利要求1所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、fab、fab'、f（ab'）2、fv、scfv和dsfv。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段。

6.一种重组载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。

8.一种用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段。

9.权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备卵巢癌和子宫内膜癌靶向药物治疗前配套的叶酸受体α伴随诊断免疫组化检测产品中的应用。

10.一种非诊断目的的检测叶酸受体α表达的方法，其特征在于，采用权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求8所述的伴随诊断试剂盒，检测离体生物样本。

技术总结
本发明公开了一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明可通过免疫组织化学法检测人卵巢癌和子宫内膜癌细胞膜组织样本中叶酸受体α的表达情况，用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒具有辅助精准用药，避免无效治疗的优点。

技术研发人员：吕萍,贺方,胡子健
受保护的技术使用者：卡秋（江苏）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17