特异性识别巴尔通体的引物对、探针及检测方法与流程

本发明涉及一种用于特异性识别巴尔通体的引物对及探针及检测方法。

背景技术：

1、巴尔通体属于细菌域，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，巴尔通体科，巴尔通体属，是一群细小、弯曲、变形、对营养要求苛刻的革兰氏染色阴性菌，是一种古老病原体。巴尔通体是重要的人兽共患病病原。巴尔通体主要引发菌血症、淋巴结炎症、心内膜炎、脑膜炎、肝炎、脾炎、关节炎以及中枢神经系统紊乱，在犬猫中已检出巴尔通体、克氏巴尔通体、文森巴尔通体伯格霍夫亚种等多种巴尔通体。因其种类多、广泛致病性及曾数度爆发流行而备受关注。巴尔通体感染作为人畜共患的传染病，具有自限性的特点，一般情况下可以经过一段时间后自我恢复，但在急性感染期和免疫力低下的病人身上，仍然具有威胁生命的危险，给人畜健康带来很大的安全威胁。

2、对于巴尔通体感染的疾病，血清学诊断只能作为辅助，而血液及组织培养分离病原体以及核酸检测才可作为确诊手段。巴尔通体生长缓慢、营养条件要求苛刻而难于分离培养是造成诊断困难的原因之一，其次所引起的疾病没有明显临床特征，许多病例未被识别出来。

3、核酸检测主要是pcr技术。pcr技术由于其简单、快速、敏感且能够特异扩增目的基因，已广泛的运用于该病原的鉴定。但是，pcr需要在严格的实验条件下进行，对实验器皿、人员操作、防污染措施都有专业性的要求，并且需要特殊精密的温控光系统仪器，成本高，反应时间长，在一定程度上限制了它的应用场景，无法达到现场快速检测的目的。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于特异性识别巴尔通体的引物、探针及检测方法，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明提供一种用于特异性识别巴尔通体的引物对，包括：引物f1和引物r1，其碱基序列分别为：

4、f1:5’-ccccttactttgtcaccaatgctgagaaaat-3’

5、r1:5’-aagattgcaatatcttctaacatggcttta-3’。

6、本发明还进一步提供一种检测巴尔通体的特异性探针，包括巴尔通体的特异性片段p1以及对应的修饰引物r4，其特异性片段p1的5’端修饰6-fam，thf取代原来位置的t碱基；所述修饰引物r4的5’端修饰biotin，r4序列与r1一致；其碱基序列分别为：

7、r4:5’-biotin-aagattgcaatatcttctaacatggcttta-3’；

8、p1:5’-6-fam-aaaccaccacgcagtttgttgacaacgagcg(thf)tgccaaagcttcacctt-3’。

9、本发明还进一步提供一种巴尔通体的检测方法，包括以下步骤：

10、s1，配制等温核酸扩增的反应体系，其中，所述反应体系包括上述的引物对和上述的特异性片段p1以及对应的修饰引物r4；

11、s2，在所述反应体系中加入待测样本；

12、s3，将加入待测样本的反应体系放置于pcr仪器中上机扩增，其中，扩增温度为35-45℃，扩增时间为20-60min；

13、s4，取扩增后的适量产物加入层析缓冲液中并置于离心管，混匀，胶体金试纸条，吸水纸端朝上，直接插入离心管中，静置后取出，将试剂条黏贴在白色基底上，判读结果。

14、作为进一步改进的，在步骤s4中，所述取扩增后的适量产物加入层析缓冲液中并置于离心管，混匀，胶体金试纸条，吸水纸端朝上，直接插入离心管中，静置后取出，将试剂条黏贴在白色基底上，判读结果的步骤具体包括：

15、取10～30μl扩增后的产物加入150～250μl层析缓冲液中置于离心管，混匀，胶体金试纸条，吸水纸端朝上，直接插入离心管中，静置5～20min后取出，将试剂条依次黏贴在白纸上，判读结果。

16、本发明的有益效果是：

17、其一、本方法是采用等温核酸扩增技术联合单向层析技术建立快速检测巴尔通体的方法，该所使用的引物探针的扩增效果较好，特异性强，灵敏度高。

18、其二、本方法结合了等温核酸扩增技术和单向层析技术，具有核酸检测的高灵敏度、高通量、高特异性的优点，同时有具有层析技术操作简单，专业要求低，结果判读直观的特点。

19、其三、本方法仅需简单的恒温仪器，摆脱了pcr技术依赖的精密温控仪器，精密光学系统，极大程度上丰富了本方法的应用场景，更加适合现场检测和家庭自测。

20、其四、本方法反应时间短，速度快，与pcr技术相比，没有变性退火延伸等变温程序，从逆转录到扩增均在恒温下进行，20min左右即可完成反应。层析反应在常温下5-10min即可，整个过程在30min左右，反应时间短，速度快，相比pcr技术更加适合现场即时快检。

技术特征：

1.一种用于特异性识别巴尔通体的引物对，其特征在于，包括：引物f1和引物r1，其碱基序列分别为：

2.一种检测巴尔通体的特异性探针，其特征在于，包括巴尔通体的特异性片段p1以及对应的修饰引物r4，其特异性片段p1的5’端修饰6-fam，thf取代原来位置的t碱基；所述修饰引物r4的5’端修饰biotin，r4序列与r1一致；其碱基序列分别为：

3.一种巴尔通体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的巴尔通体的检测方法，其特征在于，在步骤s4中，所述取扩增后的适量产物加入层析缓冲液中并置于离心管，混匀，胶体金试纸条，吸水纸端朝上，直接插入离心管中，静置后取出，将试剂条黏贴在白色基底上，判读结果的步骤具体包括：

技术总结
本发明提供了一种用于特异性识别巴尔通体的引物对及探针及检测方法。所述检测方法，包括以下步骤：S1，配制核酸等温扩增的反应体系，其中，所述反应体系包括特异性引物对和特异性探针；S2，在所述反应体系中加入待测样本；S3，将加入待测样本的反应体系放置于PCR仪器中上机扩增，其中，扩增温度为35‑45℃，扩增时间为20‑60min；S4，取扩增后的适量产物加入层析缓冲液中并置于离心管，混匀，胶体金试纸条，吸水纸端朝上，直接插入离心管中，静置后取出，将试剂条黏贴在白色基底上，判读结果。

技术研发人员：洪阅滨,陈学伟,曾祥文
受保护的技术使用者：厦门宝太生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17