区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、番木瓜（carica papaya l.）是番木瓜科番木瓜属植物，原产热带美洲，自明清时期传入中国，至今已在我国南方热带及亚热带地区多地种植，是一种用途广泛的热带草本果树，其果实营养价值高、富含蛋白酶，既可做水果鲜食，又可作工业提取与加工，被广泛应用与食品、药品等多个行业。

2、番木瓜环斑病毒（papaya ring spot virus，prsv）是番木瓜产业的毁灭性植物病毒，可造成番木瓜植株畸形、花叶、组织坏死，在热带及亚热带番木瓜产区均有流行，prsv传染性强、致死率高，对番木瓜的生产危害极大，因而番木瓜品种的prsv抗性对番木瓜引种、生产和布局十分重要。在番木瓜产业中，不同的品种具备不同的prsv抗性，在引种和作物布局工作上需要对此进行考虑，而依靠传统形态学特征对番木瓜种质进行区分较为困难，因而不同prsv抗性品种的分子生物学鉴别方法十分重要。

3、叶绿体基因组（cpdna）分子标记在植物科学领域中具有重要意义，特别是在系统发育、进化生物学、物种鉴定、种群遗传学以及生态学和保护生物学等方面。叶绿体基因组通常是单一的环形分子，大小在120-160 kb范围内，包含一系列编码光合作用、电子传递和其他生物合成途径的基因，其具有高度的遗传稳定性、低重组率和母体遗传特性。这些特点使得叶绿体基因组成为高效和可靠的分子标记，能够提供高解析度的信息，特别适用于解析疏远亲缘关系的植物和评估种群结构、基因流以及历史动态。通过比较不同物种或种群的叶绿体基因组，研究人员可以更深入地了解植物如何适应各种生态环境以及背后的演化机制，从而为生物多样性保护和可持续利用提供科学依据。

技术实现思路

1、本研究对番木瓜多个品种的叶绿体基因组测序、组装、分析，获取了在prsv抗性方面具有差异的多个番木瓜品种的叶绿体基因组差异位点，以此开发分子标记探针，区分番木瓜prsv高抗性与低抗性的品种。

2、区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，所述dna探针具有如seq id no.1所述的核苷酸序列。

3、其中，所述dna探针的核苷酸序列5’端大于等于35个碱基处插入一个四氢呋喃。

4、其中，所述dna探针上标记有示踪标记。

5、其中，所述示踪标记为同位素标记、非同位素标记中的一种或多种。

6、其中，所述非同位素标记为酶或者有色基团。

7、其中，番木瓜环斑病毒抗性品种为大青、红妃和台农，番木瓜环斑病毒低抗性品种为广蜜、红铃、桂热、琼海黄。

8、本申请提供的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的方法，包括如下步骤：

9、s1提取待测植物的叶绿体基因组dna；

10、s2以该植物的叶绿体基因组为模板进行pcr扩增，使用前述的dna探针检测叶绿体特异性基因是否存在；

11、s3若叶绿体特异性基因存在，则判断该植物为番木瓜环斑病毒抗性品种。

12、本申请还提供用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种的试剂盒，该试剂盒包括前述的dna探针。

13、根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现了多个差异位点，其中10 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同prsv抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的dna作为模板进行pcr扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定。

14、对pcr扩增产物进行sanger测序，并将测序结果进行比对，比对结果证实在此位点存在一个20 bp的差异位点能够将prsv高抗性与低抗性的番木瓜品种区分开，依据该位点设计了寡核苷酸荧光探针，可应用rpa（recombinase polymerase amplification）等分子生物学方法对番木瓜叶片组织进行检测，通过是否存在荧光信号即可实现其分子鉴定，以此能够高效区分番木瓜不同prsv抗性的品种。

技术特征：

1.区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述dna探针具有如seq.id.no.1所述的核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述dna探针的核苷酸序列5’端大于等于35个碱基处插入一个四氢呋喃。

3.根据权利要求1所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述dna探针上标记有示踪标记。

4.根据权利要求3所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述示踪标记为同位素标记、非同位素标记中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的区分番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述非同位素标记为酶或者有色基团。

6.根据权利要求1-5任一所述的番木瓜环斑病毒抗性品种的dna探针，其特征在于，所述番木瓜环斑病毒抗性品种为大青、红妃和台农，番木瓜环斑病毒低抗性品种为广蜜、红铃、桂热、琼海黄。

7.区分番木瓜环斑病毒抗性品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括如权利要求1-6任一所述的dna探针。

技术总结
本发明涉及区分番木瓜环斑病毒抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法，该DNA探针具有如SEQ.ID.NO.1所述的核苷酸序列；该DNA探针用于区分番木瓜环斑病毒抗性品种和番木瓜环斑病毒低抗性品种。根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现10 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同PRSV抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的DNA作为模板进行PCR扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定并依据差异位点设计了DNA探针。

技术研发人员：贾瑞宗,郝志刚,张季楠,郭静远,郭运玲,郭安平
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31