一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记引物组合及检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的indel标记引物组合及检测方法。

背景技术：

1、樱花是蔷薇科rosaceae李属prunus樱亚属subg.cerasus植物的统称，因其具有极佳的观赏价值，在园林造景和城市美化方面得以广泛应用。樱属植物主要分布于北半球的温带与亚热带地区，全世界樱属植物150余种，中国有52种及变种，三分之一以上的樱属植物原产于中国。我国樱属植物不仅种类多，变异类型也十分丰富，具有广阔的开发利用前景。山樱花(prunus serrulata)、高盆樱桃(p.cerasoides)、尾叶樱桃(p.dielsiana)和钟花樱桃(p.campanulata)等野生樱花资源观赏性好，适应性强，遗传多样性丰富，是优异樱花种质创制和新品种培育的珍贵材料。

2、近百年来，人们通过自然变异筛选和杂交培育的方式获得了800多个樱花园艺品种。针对这些园艺品种，分类学家根据树形、花、果、叶、冬芽等形态特性提出三级、五级分类标准及花期、花色分类标准。由于不同学者对形态性状的判断标准存在差异，品种间性状交叉、重叠及在不同环境中具有很强的可塑性等，造成形态学鉴定的困难，从而造成品种名混淆，同物异名、异物同名等现象时常发生；且多数樱花先花后叶，花叶不同期，易于杂交，形态变异丰富多样，生活史长、花期相对较短，缺乏快速准确的鉴定方法。

3、‘湘妍’是从钟花樱自然变异选育的樱花新品种，其花色艳丽，树体高大，具有较高的园林观赏价值和广阔的应用前景，同时也是杂交育种的重要亲本；‘敬翁’是日本樱花品种，亲本可能是中国樱桃(p.pseudocerasus)和钟花樱，有待考证。实践证明，以‘湘妍’为父本，‘敬翁’为母本杂交而来的后代遗传变异较为丰富，有些个体的叶片等营养器官兼有父母本的特征，而有些个体的形态特征和母本基本一致，无明显差异，无法通过形态学特征进行鉴定，加之周期长，且受生长发育和环境的影响，无法满足鉴定杂交后代的需要。因此，急需建立快速、准确、高效的樱花杂交后代分子鉴定技术体系，缩短育种周期，加快育种进程，促进我国樱花品种选育、推广以及种业高质量发展。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本方案基于基因组重测序技术，挖掘适用于樱花基因型分析和杂交f1代鉴定的插入缺失突变(insert-deletion,indel)位点，筛选可用于鉴定湘妍和敬翁杂交后代的indel标记，然后利用湘妍、敬翁及其杂交f1代的基因组dna对候选标记进行验证，获得特异性好、分辨率高的标记，达到快速、准确、高效鉴定杂交f1代的目的。

2、为达到上述目的，本方案首先提供了一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的indel标记引物组合，其特征在于，所述indel标记引物组合包括ida2标记引物组、ida13标记引物组和idb17标记引物组；

3、所述ida2标记引物组的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；

4、所述ida13标记引物组的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示；

5、所述idb17标记引物组的核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示。

6、基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种indel标记引物组合在检测樱花品种湘妍和敬翁杂交f1代真实性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7、s1、采用改良ctab法提取湘妍、敬翁和待测杂交f1代样本叶片的总dna；

8、s2、以s1步骤的总dna为扩增模板，分别以权利要求1所述的3个标记引物组作为扩增引物，进行pcr扩增；

9、s3、对s2步骤的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待测f1代样本在ida2或ida13或idb17标记的扩增产物中具有父本的特异性条带，则待测杂交f1代样本是真正的湘妍、敬翁杂交后代；

10、所述s1步骤中湘妍为父本，敬翁为母本。

11、作为优选，所述s2步骤中pcr扩增的反应体系为：2×taq master mix 12.5μl，10μmol/l上、下游引物各1μl，ddh2o 9.5μl，50ng/μl的湘妍、敬翁或待测试f1代材料的dna 1μl。

12、作为优选，所述s2步骤中pcr扩增的反应程序为：ida2标记的pcr反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；ida13标记的pcr反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；idb17标记的pcr反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，49℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存

13、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

14、(1)本发明提供的检测方法降低了对形态学鉴定的依赖，设计的indel标记属于第三代分子标记，其稳定性好、特异性强、操作简便，且不受植物发育时期、生长阶段和环境影响，仅需微量新鲜组织或硅胶快速干燥组织样品便可准确、快速地鉴定待测样品，在仪器设备齐全的前提下，仅需3小时左右便可得到检测结果。

15、(2)本发明提供的3个indel标记对12个湘妍和敬翁的杂交f1代进行了检测，通过pcr产物电泳分析，结果表明：结合ida2、ida13和idb17标记可以鉴定9个杂交f1代，鉴定率为75％，通过实验重复，准确率可达到100％。

技术特征：

1.一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的indel标记引物组合，其特征在于，所述indel标记引物组合包括ida2标记引物组、ida13标记引物组和idb17标记引物组；

2.一种如权利要求1所述的indel标记引物组合在检测樱花品种湘妍和敬翁杂交f1代真实性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述s2步骤中pcr扩增的反应体系为：2×taq master mix 12.5μl，10μmol/l上、下游引物各1μl，ddh2o 9.5μl，50ng/μl的湘妍、敬翁或待测试f1代材料的dna 1μl。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述s2步骤中pcr扩增的反应程序为：ida2标记的pcr反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；

技术总结
本发明提供了一种鉴定樱花品种湘妍(父本)和敬翁(母本)杂交后代的InDel标记引物组合及检测方法，属于分子生物学领域；本方案提供的InDel标记引物组合，包括IDA2标记引物组、IDA13标记引物组和IDB17标记引物组，以此为PCR扩增引物来扩增湘妍，敬翁及待测杂交F1代的总DNA，若待测杂交F1代樱花的扩增产物电泳后含有父代湘妍的特异性条带，则待测杂交F1代为真正的湘妍和敬翁杂交后代，本发明对12个湘妍和敬翁的杂交F1代进行了检测，通过PCR产物电泳分析，结果表明：结合IDA2、IDA13和IDB17标记可以鉴定9个杂交F1代，鉴定率为75％，通过实验重复，准确率可达到100％。

技术研发人员：李建挥,严佳文,舒东膂,王思瑶,郑硕理,陈白冰,何艳,杨扬,阳秀玫,胡景堃
受保护的技术使用者：湖南省植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29