一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记及其应用

本发明属于蔬菜分子标记辅助育种，具体涉及一种与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记及其应用。

背景技术：

1、冬瓜（benincasa hispida cogn.）是葫芦科(cucurbitaceae)重要蔬菜作物，其产量高、耐贮存，在保障蔬菜周年供应及农产品加工等方面发挥重要作用。种子大小能够在一定程度上影响冬瓜的种子产量、发芽率和发芽势，因此，对冬瓜种子大小进行基因定位，开发紧密连锁的分子标记，通过分子标记对冬瓜种子大小性状进行苗期辅助选择，将有效的节省育种时间和用地，加快育种进程，对冬瓜品种选育具有重要的实践意义。

2、kasp（kompetitive allele-specific pcr），即竞争性等位基因特异性pcr，与传统pcr方法相比，kasp技术具有通量高、成本低、效率高、无需电泳检测等优点。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记、检测所述kasp分子标记的引物和试剂盒。

2、本发明的目的还在于提供一种冬瓜种子大小的鉴定方法。

3、本发明的最后一个目的在于提供检测上述kasp分子标记的试剂、引物、试剂盒或方法在在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记，所述kasp分子标记根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位的snp位点设计，该snp位点存在g/c的碱基突变，对应的基因型包括g:g、g:c和c:c，其中g:g和g:c基因型表现为大种子的基因型，c:c基因型表现为小种子的基因型，所述kasp分子标记可通过如seq id no.1~ seq id no.3所示的引物扩增得到。

5、本发明第16823593位的snp位点在大种子中该snp位点为g，在小种子中该snp位点为c。

6、其中冬瓜基因组的版本号为wax gourd (benincasahispida cv. b227) genome。

7、本发明还提供了一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记的引物，所述引物包括两条特异性上游引物bhssa1和bhssa2，以及一条通用下游引物bhssc1，其中所述上游引物bhssa1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述上游引物bhssa2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游引物bhssc1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述上游引物bhssa1的5’端添加有fam荧光标签序列，所述上游引物bhssa2的5’端添加有hex荧光标签序列。

8、具体地，本发明提供的检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记的引物，包含三条引物，其中两条上游引物bhssa1和bhssa2是根据snp位点设计的特异性引物，引物3’末端为变异的碱基，5’端分别连接羧基荧光素fam（gaaggtgaccaagttcatgct）和六氯荧光素氨基磷酸酯hex（gaaggtcggagtcaacggatt）荧光信号标签序列，下游引物bhssc1是一条通用引物，三条引物序列如下所示：

9、bhssa1：

10、5’-gaaggtgaccaagttcatgctagccaatcccacggcggg-3’（seq id no.1），下划线部分为荧光素fam的序列。

11、bhssa2：

12、5’-gaaggtcggagtcaacggattagccaatcccacggcggc-3’（seq id no.2），下划线部分为荧光素hex的序列。

13、bhssc1：

14、5’-ggttaaagtgggctacattcttggctt-3’（seq id no.3）。

15、采用该引物进行pcr扩增，对扩增产物进行荧光检测，将荧光信号结合标记信息，完成基因分型。

16、大种子材料的基因型有2种，其中基因型为“g:g”类型的大种子材料荧光信号呈蓝色，聚集在靠近y轴位置，基因型为“g:c”类型的大种子材料荧光信号呈绿色，聚集在靠近中间位置，小种子材料的基因型有1种为“c:c”，荧光信号呈橙色，聚集在靠近x轴位置。

17、本发明还进一步提供了一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记的试剂盒，包括所述的引物。

18、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种冬瓜种子大小的鉴定方法，包括以下步骤：

19、（1）提取待测冬瓜的dna；

20、（2）采用所述引物或所述试剂盒进行pcr扩增，得到pcr产物；

21、（3）所述pcr产物经荧光检测后进行基因分型，所述kasp分子标记的分型中，基因型为g:g类型，判定为大种子纯合材料；基因型为g: c类型，判定为大种子杂合材料；基因型为c:c，判定为小种子纯合材料。

22、本发明所述pcr产物经荧光检测后，对pcr扩增产物进行分型检测，并以图表的形式呈现出来；图表分为x、y轴，每一个数据点代表一个独立的dna样品，相同基因型的样品会聚堆在一起，其中基因型为g:g类型，荧光信号呈蓝色，聚集在靠近y轴的材料，判定为大种子纯合材料；基因型为g: c类型，荧光信号呈绿色，聚集在靠近中间位置，判定为大种子杂合材料；基因型为c:c，荧光信号呈橙色，聚集在靠近x轴，判定为小种子纯合材料。

23、本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：检测所述kasp分子标记的试剂在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。

24、本发明还提供了检测所述kasp分子标记的试剂在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

25、本发明还提供了上述检测所述kasp分子标记的引物或试剂盒在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

26、本发明还进一步提供了上述方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用以及在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

27、具体地，上述检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp标记的引物、试剂盒或方法用于冬瓜种子大小辅助选择时，群体单株种子大小表型与上述分子标记的引物或试剂盒扩增的带型一致。

28、本发明具有以下优点：本发明中的kasp分子标记引物可在苗期快速鉴定冬瓜的种子大小表型，并具有准确、快速、成本低、鉴定周期短、操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记，其特征在于：所述kasp分子标记根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位的snp位点设计，该snp位点存在g/c的碱基突变，对应的基因型包括g:g、g:c和c:c，其中g:g和g:c基因型表现为大种子的基因型，c:c基因型表现为小种子的基因型，所述kasp分子标记可通过如seq id no.1~ seq id no.3所示的引物扩增得到。

2.一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记的引物，其特征在于：所述引物包括两条特异性上游引物bhssa1和bhssa2，以及一条通用下游引物bhssc1，其中所述上游引物bhssa1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述上游引物bhssa2的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述下游引物bhssc1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述上游引物bhssa1的5’端添加有fam荧光标签序列，所述上游引物bhssa2的5’端添加有hex荧光标签序列。

3.一种检测与冬瓜种子大小紧密连锁的kasp分子标记的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的引物。

4.一种冬瓜种子大小的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

5.检测权利要求1所述kasp分子标记的试剂在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。

6.检测权利要求1所述kasp分子标记的试剂在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

7.权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。

8.权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

9.权利要求4所述方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型中的应用。

10.权利要求4所述方法在冬瓜分子标记辅助育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种与冬瓜种子大小紧密连锁的KASP分子标记，根据冬瓜基因组第10染色体上第16823593位SNP位点设计，该SNP位点存在G/C的碱基突变，其中G:G和G:C基因型表现为大种子的基因型，C:C基因型表现为小种子的基因型。还公开了一种检测所述KASP分子标记的引物和试剂盒以及利用所述引物鉴定冬瓜种子大小的方法，还公开了检测上述分子标记的试剂、引物、试剂盒或方法在苗期鉴定冬瓜种子大小表型以及冬瓜分子标记辅助育种中的应用。本发明中的引物或试剂盒可在苗期快速鉴定冬瓜的种子大小表型，并具有准确、快速、成本低、鉴定周期短、操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：刘文睿,郦斐鸿,闫晋强,谢大森,江彪,杨松光,王敏,陈林,蔡金森
受保护的技术使用者：广东省农业科学院蔬菜研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24