鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法、引物、探针及应用

本发明属于植物鉴定的，具体涉及鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法、引物、探针及应用。

背景技术：

1、滇重楼(paris yunnanensis) 为黑药花科重楼属多年生药用植物，以干燥根茎入药，具有清热解毒、止痛消肿、凉肝定惊等功效，还有抗肿瘤、抗病毒、消炎等药理作用。近年来由于药用需求增多而被大肆采挖，滇重楼野生资源逐渐枯竭，人工大面积栽培已成为长期的发展趋势，且滇重楼遗传纯合个体和杂合个体在药效上有一定区别，为了更好的按需对滇重楼进行栽培，须在栽培前对其进行鉴别。

2、滇重楼药用植物的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在dna序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用dna分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。dna分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，rflp、ssr、rapd、ap-pcr、aflp、issr、snp等技术相继应用于药用植物的鉴别鉴定。然而这些技术除了需要进行pcr扩增还需要通过电泳或测序技术呈现鉴定结果，存在操作步骤繁琐、工作量大、人为干扰大、检测灵敏度低、特异性和实验结果重复性差等弱点，特别是在鉴定工业加工、高温烘干过的药材，难以在实际中得到应用，而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和基因组时代的到来，一些新的药用植物的鉴定提供了新的方法。

3、实时荧光pcr技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，使用一组或多组特异性的引物探针，通过监测荧光强度变化达到鉴定的目的，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测效率高等优势，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的鉴定方法可靠性差、操作复杂、工作量大、实验结果重复性差等不足，提供一种鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法、引物、探针及应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、一种鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组dna为模板，采用引物a1-f、a1-r和探针a1-probe进行实时荧光定量pcr扩增反应，检测ct值小于40，则鉴定为滇重楼遗传纯合个体；所述引物a1-f的序列如seq id no.1所示，所述引物a1-r的序列如seqid no.2所示，所述探针a1-probe的序列如seq id no.3所示。

4、上述引物和探针的序列如表1。

5、具体的，上述探针a1-probe的5’端修饰fam，探针a1-probe的3’端修饰mgb。

6、具体的，上述模板最低检测下限为0.0001ng/μl。

7、具体的，上述实时荧光定量pcr扩增的反应体系为：2xt5 fast qpcr mix 10μl、10um的上游引物0.7μl、10um的下游引物0.7μl、10um的探针0.6μl、待测模板1μl，使用ddh2o补足至20μl反应体系。

8、具体的，上述实时荧光定量pcr扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。

9、本发明的第二方面提供鉴别滇重楼遗传纯合个体的引物对，所述引物对由引物a1-f和a1-r组成，所述引物a1-f的序列如seq id no.1所示，所述引物a1-r的序列如seq idno.2所示。

10、本发明的第三方面提供鉴别滇重楼遗传纯合个体的探针，所述探针a1-probe的序列如seq id no.3所示。

11、本发明的第四方面提供鉴别滇重楼遗传纯合个体的试剂，含有上述的引物对和上述的探针。

12、本发明的第五方面提供上述试剂在鉴别滇重楼遗传纯合个体中的应用。

13、表1滇重楼遗传纯合个体引物探针序列

14、

15、本发明的有益效果是：

16、本发明的鉴别方法及试剂具有极佳的特异性和灵敏度，通过对检测ct值的判断就能够准确地鉴定或检测重楼属中的滇重楼遗传纯合个体，实现了对滇重楼遗传纯合个体的快速鉴定。

技术特征：

1.鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组dna为模板，采用引物a1-f、a1-r和探针a1-probe进行实时荧光定量pcr扩增反应，检测ct值小于40，则鉴定为滇重楼遗传纯合个体；所述引物a1-f的序列如seq id no.1所示，所述引物a1-r的序列如seq id no.2所示，所述探针a1-probe的序列如seq id no.3所示。

2.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，其特征在于：所述探针a1-probe的5’端修饰fam，所述探针a1-probe的3’端修饰mgb。

3.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，其特征在于：所述模板最低检测下限为0.0001ng/μl。

4.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，其特征在于：所述实时荧光定量pcr扩增的反应体系为：2xt5 fast qpcr mix 10μl、10um的上游引物0.7μl、10um的下游引物0.7μl、10um的探针0.6μl、待测模板1μl，使用ddh2o补足至20μl反应体系。

5.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法，其特征在于：所述实时荧光定量pcr扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。

6.鉴别滇重楼遗传纯合个体的引物对，其特征在于：所述引物对由引物a1-f和a1-r组成，所述引物a1-f的序列如seq id no.1所示，所述引物a1-r的序列如seq id no.2所示。

7.鉴别滇重楼遗传纯合个体的探针，其特征在于：所述探针a1-probe的序列如seq idno.3所示。

8.鉴别滇重楼遗传纯合个体的试剂，其特征在于：含有权利要求6所述的引物对和权利要求7所述的探针。

9.权利要求8所述的试剂在鉴别滇重楼遗传纯合个体中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法、引物、探针及应用，涉及植物鉴定的技术领域，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物A1‑F、A1‑R和探针A1‑probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为滇重楼遗传纯合个体；所述引物A1‑F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物A1‑R的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针A1‑probe的序列如SEQ ID No.3所示。本发明具有极佳的特异性和灵敏度，能够对滇重楼遗传纯合个体进行快速、可靠的鉴定。

技术研发人员：纪运恒,李德铢,张志荣,王红,杨志云,王磊
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29