一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法

本发明涉及免疫药物的，尤其涉及一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，具体涉及细菌菌影与肿瘤抗原的组合应用，属于微生物及肿瘤免疫调控领域。

背景技术：

1、黑色素瘤是一种高度恶的皮肤肿瘤，其治疗一直是医学领域的挑战之一。传统的治疗方法包括手术切除、放射疗法和化学疗法，但这些方法存在着局限性，如手术可能无法完全切除病变组织，放疗和化疗则可能对正常组织造成严重的损伤，同时患者也可能出现耐药性。

2、免疫治疗作为一种新型的治疗手段，近年来备受关注。它通过激活患者自身的免疫系统来攻击和消灭肿瘤细胞，具有针对性强、副作用小等优点。然而，免疫治疗在黑色素瘤治疗中也存在一些挑战，如免疫耐受性、免疫逃逸等问题，限制了其临床应用。因此，现有技术方法中用于免疫治疗的免疫药物存在应用效果较差的问题。

技术实现思路

1、本发明实施例提供了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，旨在解决现有技术方法中用于免疫治疗的免疫药物存在应用效果较差的问题。

2、第一方面，本发明实施例提供了一种菌影的制备方法，其中，所述制备方法包括：

3、将pet29a-e-α3质粒与ecn/δtnaa::t7 rnap感受态细胞混合后电击，并28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；

4、将所述重组菌株于lb培养基中培养并加入iptg诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；

5、收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影；

6、所述将pet29a-e-α3质粒与ecn/δtnaa::t7 rnap感受态细胞混合后电击，并在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株，包括：

7、质粒孵育：在50~200ul ecn/δtnaa::t7 rnap 感受态细胞悬液中加入1~10ulpet29a- e-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育 3~5 min；所述pet29a-e-α3质粒的浓度为50~200ng/ul；所述感受态的浓度为1*10^7cfu；

8、电转：使菌液均匀地分布于电击杯中，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：1.5kv、电阻 200 ω、电容 25 μf；电击后迅速加入 1 ml 无抗 lb 液体培养基，轻轻吹打均匀；

9、复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1 h 进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000 rpm离心 30 s，弃掉 800 μl的上清液，将剩余菌体沉淀重悬；

10、涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的 lb 固体培养基，37℃过夜培养；

11、再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入plyss-ompa-atram质粒，再次进行电转的步骤，并涂布菌体沉淀于含卡那霉素及 氯霉素的lb 固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；所述plyss-ompa-atram质粒的浓度为50~200ng/ul。

12、第二方面，本申请实施例还提供了一种组合物，其中，所述组合物包括以质量比为2:1~30:1进行混合的大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原；所述大肠杆菌菌影应用如上述第一方面所述的制备方法制备得到。

13、第三方面，本申请实施例还提供了一种组合物的制备方法，所述制备方法用于制备如上述第二方面所述的组合物，制备方法包括：

14、将大肠杆菌菌影以及黑色素瘤相关抗原以质量比为2:1~30:1进行混合后，得到混合物；

15、将所述混合物于36-39℃溶于1×pbs溶液并于170-250rpm的摇床孵育0.6-1.5小时，得到对应的组合物。

16、本发明实施例提供了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pet29a-e-α3质粒与ecn/δtnaa::t7 rnap感受态细胞混合后在28-40℃下孵育0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于lb培养基中培养并加入iptg诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明在摇床作用下将质粒转入感受态细胞中并筛选得到重组菌株，通过培养并诱导噬菌体α3裂解蛋白表达后制备得到大肠杆菌菌影，该大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂与黑色素瘤相关抗原进行组合使用，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。

技术特征：

1.一种菌影的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

2.根据权利要求1所述菌影的制备方法，其特征在于，所述将所述重组菌株于lb培养基中培养并加入iptg诱导噬菌体α3裂解蛋白表达，包括：

3.根据权利要求1所述菌影的制备方法，其特征在于，所述收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到大肠杆菌菌影，包括：

4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括以质量比为2:1~30:1进行混合的大肠杆菌菌影及黑色素瘤相关抗原；所述大肠杆菌菌影应用如权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到。

5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述大肠杆菌菌影为大肠杆菌 nissle1917菌影和/或表面展示酸触发性理性膜肽的大肠杆菌nissle 1917菌影。

6.根据权利要求4所述组合物，其特征在于，所述黑色素瘤相关抗原为模式抗原ova（257-264）。

7.一种组合物的制备方法，所述制备方法用于制备如权利要求4-6任一项所述的组合物，其特征在于，所述制备方法包括：

8.根据权利要求7所述组合物的制备方法，其特征在于，所述混合物进行结合的温度为37℃。

技术总结
本发明公开了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pET29a‑E‑α3质粒与EcN/ΔtnaA::T7 RNAP感受态细胞混合后在28‑40℃下孵育0.5‑1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明利用特定方法制备大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂后与肿瘤抗原进行组合，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。

技术研发人员：马毅,许悦,王菊芳
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16