本发明涉及光学探针，尤其涉及一种肌醇光学探针及其制备方法和应用。
背景技术：
1、肌醇(myo-iositol，mi)是一种天然存在于动物和植物细胞中的环醇，以其游离形式或作为磷脂或肌醇磷酸衍生物的结合组分。它在各种细胞过程中发挥着重要作用，是真核细胞中第二信使的结构基础，特别是作为肌醇三磷酸(ip3)、磷脂酰肌醇磷脂(pip2/pip3)和可能的肌醇聚糖。因此，肌醇对广泛细胞功能的平稳运行至关重要，包括细胞生长和存活、外周神经的发育和功能、成骨和繁殖。
2、目前最常用的检测肌醇的方法有高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法(guo j等.clinica chimica acta,2016,460(6),88-92)、同位素标记法(heiden m g v等，science,2010,329(5998),1492-1499)和酶活检测方法等。高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法可以高效并精准地测定样品中肌醇的含量变化，但其中涉及细胞内代谢物的提取，实验步骤繁琐且周期较长。同位素标记法和酶活检测法均不能实时监控活细胞内肌醇的变化，因此亟需开发出能够原位监测活细胞内肌醇动态变化的遗传编码荧光探针。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测肌醇的探针和方法。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明第一方面提供一种肌醇结合蛋白变体，其：
4、(a)具有seq id no:1所示的序列或其截去第2-45位氨基酸的功能片段并且在选自以下的1个、2个、3个、4个或更多个位点具有突变：d62、h137、q180、l235、d260、q280、p313、f314，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失，所述位点编号按照seq id no:1序列，
5、(b)是与(a)的序列具有至少70％序列相同性并具有(a)所述突变并保留对肌醇结合能力的序列。
6、在一个或多个实施方案中，所述肌醇结合蛋白变体具有seq id no:1所示的序列或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段，并且：(a)在选自以下的1个、2个或更多个位点具有突变：p313、f314，和/或，(b)在选自以下的1个、2个、3个、4个或更多个位点具有突变：d62、h137、q180、l235、d260、q280、p313、f314。
7、在一个或多个实施方案中，所述突变包括选自以下任一组的位点处的突变：(1)p313和f314；或者，所述突变包含选自以下任一组的位点处的突变：(2)p313、f314和d260，(3)p313、f314、d260和l235，(4)p313、f314和l235，(5)p313、f314和q280，(6)p313、f314、d260和q280。
8、在一个或多个实施方案中，l235突变为g、y、a或i。在一个或多个实施方案中，d260突变为l、v、w、s、f或y。在一个或多个实施方案中，q280突变为s、g或y。在一个或多个实施方案中，p313突变为a、l、p、r、s、f、g、y、c或v。在一个或多个实施方案中，f314突变为i、c、l、v、w、h或m。
9、在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下任一组的突变：(1)p313a和f314i，(2)p313l和f314c，(3)p313p和f314l，(4)p313a和f314l，(5)p313l和f314v，(6)p313l和f314i，(7)p313r和f314i，(8)p313s和f314v，(9)p313f和f314c，(10)p313g和f314c，(11)p313r和f314v，(12)p313y和f314c，(13)p313y和f314l，(14)p313f和f314l，(15)p313c和f314w，(16)p313v和f314h，(17)p313y和f314v，(18)p313f和f314m，(19)p313a、f314l和d260l，(20)p313a、f314l和d260v，(21)p313a、f314l、d260l和l235g，(22)p313a、f314l、d260v和l235g，(23)p313a、f314l和d260w，(24)p313a、f314l和d260s，(25)p313a、f314l和d260f，(26)p313a、f314l和d260y，(27)p313a、f314l和l235y，(28)p313a、f314l和l235a，(29)p313a、f314l和l235i，(30)p313a、f314l和q280s，(31)p313a、f314l和q280g，(32)p313a、f314l和q280y，(33)p313a、f314l、d260l和q280s，(34)p313a、f314l、d260v和q280s，(35)p313a、f314l、d260w和q280s，(36)p313a、f314l、d260f和q280s，(37)p313a、f314l、d260v和q280g。
10、本发明另一方面提供一种肌醇光学探针，包含肌醇敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的序列内。肌醇敏感多肽被光学活性多肽分为第一部分和第二部分。
11、在一个或多个实施方案中，所述肌醇光学探针，包括肌醇敏感多肽b和光学活性多肽a，其中光学活性多肽a位于肌醇敏感多肽b的序列内，将肌醇敏感多肽b分为第一部分b1和第二部分b2，形成b1-a-b2式的探针结构。
12、在一个或多个实施方案中，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：153/153，153/154，154/153，154/154，279/279，279/280，279/281，280/279，280/280，280/281，281/279，281/280，281/281，312/312，312/313，312/314，313/312，313/313，313/314，314/312，314/313，314/314。
13、在一个或多个实施方案中，所述肌醇敏感多肽是肌醇结合蛋白或其功能变体。
14、在一个或多个实施方案中，肌醇敏感多肽具有：
15、(1)seq id no:1所示的序列或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段，或与它们有至少70％序列相同性并保留对肌醇结合活性的序列，
16、(2)本文第一方面任一实施方案所述的肌醇结合蛋白变体的序列，或
17、(3)与(2)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(2)所述突变并保留对肌醇敏感性的序列。
18、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体，其中，荧光蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的3个氨基酸内具有突变。
19、在一个实施方式中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白。在一个实施方式中，荧光蛋白具有seq id no:2-5中任一所示的序列。
20、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白的功能变体在第1-3位或244-246位，优选第1位或第246位，的氨基酸处具有突变。优选地，荧光蛋白的功能变体包括荧光蛋白的第1位氨基酸突变为t、s、n或g的突变，和/或，荧光蛋白的第246位氨基酸突变为f或c的突变。
21、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白的功能变体具有seq id no:2所示的序列并在y1位点具有突变。优选地，所述突变为y1r、y1s、y1n或y1g，和/或
22、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白的功能变体具有seq id no:2所示的序列并在n246位点具有突变。优选地，所述突变为n246f或n246c。
23、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白具有seq id no:2所示的序列或是其第1位氨基酸处具有以下任一组所示突变的变体：y1r、y1s、y1n或y1g，和/或，其第246为氨基酸处具有以下任一组所示突变的变体：n246f或n246c，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的314/313位点。
24、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白具有seq id no:2所示的序列或是其第1位氨基酸处具有以下任一组所示突变的变体：y1r、y1s、y1n或y1g，和/或，其第246为氨基酸处具有以下任一组所示突变的变体：n246f或n246c，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的313/313位点。
25、在一个实施方式中，光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头，例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸y。在一个实施方式中，接头y位于光学活性多肽的n端和/或c端。在一个实施方式中，光学探针如下所示：肌醇敏感多肽的第一部分b1、y、光学活性多肽a、肌醇敏感多肽的第二部分b2。在一个实施方式中，本发明光学探针不包含接头。
26、在一个实施方式中，本发明光学探针还包含定位序列，用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。
27、在一个或多个实施方案中，所述肌醇敏感多肽的序列如seq id no:1所示或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段所示，所述光学活性多肽如seq id no:2-5中任一项所示，所述光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：153/153，153/154，154/153，154/154，279/279，279/280，279/281，280/279，280/280，280/281，281/279，281/280，281/281，312/312，312/313，312/314，313/312，313/313，313/314，314/312，314/313，314/314。所述位点编号按照seq id no:1序列。
28、在一个或多个实施方案中，肌醇敏感多肽如seq id no:1所示或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段所示，光学活性多肽如seq id no:2-5所示或是其在对应于seq idno:2的第1位或第246位氨基酸的氨基酸处具有选自以下任一个或多个突变的变体：y1r、y1s、y1n、y1g、n246f或n246c。光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：153/153，153/154，154/153，154/154，279/279，279/280，279/281，280/279，280/280，280/281，281/279，281/280，281/281，312/312，312/313，312/314，313/312，313/313，313/314，314/312，314/313，314/314。
29、在一个或多个实施方案中，所述光学探针中，肌醇敏感多肽如seq id no:1所示或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段所示，并且具有以下的一个或多个突变：d62、h137、q180、l235、d260、q280、p313、f314。在一个或多个实施方案中，光学活性多肽如seq id no:2-5所示或是其在对应于seq id no:2的第1位或第246位氨基酸的氨基酸处具有选自以下任一个或多个突变的变体：y1r、y1s、y1n、y1g、n246f或n246c，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的153/153，153/154，154/153，154/154，279/279，279/280，279/281，280/279，280/280，280/281，281/279，281/280，281/281，312/312，312/313，312/314，313/312，313/313，313/314，314/312，314/313，314/314位点。优选地，肌醇敏感多肽的突变包含选自以下任一组的突变：(1)p313a和f314i，(2)p313l和f314c，(3)p313p和f314l，(4)p313a和f314l，(5)p313l和f314v，(6)p313l和f314i，(7)p313r和f314i，(8)p313s和f314v，(9)p313f和f314c，(10)p313g和f314c，(11)p313r和f314v，(12)p313y和f314c，(13)p313y和f314l，(14)p313f和f314l，(15)p313c和f314w，(16)p313v和f314h，(17)p313y和f314v，(18)p313f和f314m，(19)p313a、f314l和d260l，(20)p313a、f314l和d260v，(21)p313a、f314l、d260l和l235g，(22)p313a、f314l、d260v和l235g，(23)p313a、f314l和d260w，(24)p313a、f314l和d260s，(25)p313a、f314l和d260f，(26)p313a、f314l和d260y，(27)p313a、f314l和l235y，(28)p313a、f314l和l235a，(29)p313a、f314l和l235i，(30)p313a、f314l和q280s，(31)p313a、f314l和q280g，(32)p313a、f314l和q280y，(33)p313a、f314l、d260l和q280s，(34)p313a、f314l、d260v和q280s，(35)p313a、f314l、d260w和q280s，(36)p313a、f314l、d260f和q280s，(37)p313a、f314l、d260v和q280g。
30、在一个或多个实施方案中，所述光学探针中，肌醇敏感多肽如seq id no:1所示或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段所示，光学活性多肽如seq id no:2-5所示，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的313/313位点，并且，所述光学探针具有如下所示的突变：(1)肌醇敏感多肽的p313a和f314i，(2)肌醇敏感多肽的p313l和f314c，(3)肌醇敏感多肽的p313p和f314l，(4)肌醇敏感多肽的p313a和f314l，(5)肌醇敏感多肽的p313l和f314v，(6)肌醇敏感多肽的p313l和f314i，(7)肌醇敏感多肽的p313r和f314i，(8)肌醇敏感多肽的p313s和f314v，(9)肌醇敏感多肽的p313f和f314c，(10)肌醇敏感多肽的p313g和f314c，(11)肌醇敏感多肽的p313r和f314v，(12)肌醇敏感多肽的p313a、f314l，和光学活性多肽的1s，(13)肌醇敏感多肽的p313a、f314l，和光学活性多肽的1n，(14)肌醇敏感多肽的p313a、f314l，和光学活性多肽的1t，(15)肌醇敏感多肽的p313a、f314l，和光学活性多肽的1s、246c，(16)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和d260l，(17)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和d260v，(18)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260l，和光学活性多肽的1s，(29)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260l、l235g，和光学活性多肽的1s，(20)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260v，和光学活性多肽的1s，(21)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260v、l235g，和光学活性多肽的1n，(22)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260w，和光学活性多肽的1s，(23)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260s，和光学活性多肽的1s，(24)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260f，和光学活性多肽的1t，(25)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260y，和光学活性多肽的1t，(26)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和l235y，(27)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和l235a，和光学活性多肽的1s，(28)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和l235i，和光学活性多肽的1t，(29)肌醇敏感多肽的p313a、f314l和q280s，(30)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、q280g，和光学活性多肽的1s，(31)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、q280y，和光学活性多肽的1t，(32)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260l、q280s，和光学活性多肽的1n，(33)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260v、q280s，和光学活性多肽的1s，(34)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260w、q280s，和光学活性多肽的246c，(35)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260f、q280s，和光学活性多肽的1s、246c，(36)肌醇敏感多肽的p313a、f314l、d260v、q280g，和光学活性多肽的1g、246c。
31、在一个或多个实施方案中，所述光学探针中，肌醇敏感多肽如seq id no:1所示或其截去第2-45位氨基酸后的功能片段所示，光学活性多肽如seq id no:2-5所示，光学活性多肽位于肌醇敏感多肽的314/313位点，并且，所述光学探针具有如下所示的突变：(37)肌醇敏感多肽的p313y和f314c，(38)肌醇敏感多肽的p313y和f314l，(39)肌醇敏感多肽的p313f和f314l，(40)肌醇敏感多肽的p313c和f314w，(41)肌醇敏感多肽的p313v和f314h，(42)肌醇敏感多肽的p313y和f314v，(43)肌醇敏感多肽的p313f和f314m，(44)肌醇敏感多肽的p313f、f314m，和光学活性多肽的1t、246f，(45)肌醇敏感多肽的p313y、f314c，和光学活性多肽的1t、246f，(46)肌醇敏感多肽的p313y、f314l，和光学活性多肽的1t、246f。
32、在一个或多个实施方案中，所述光学探针如seq id no:7-8所示。
33、本发明另一方面还提供融合多肽，包含本文所述光学探针和其它多肽。在一些实施方式中，其他多肽位于所述光学探针的n端和/或c端。在一些实施方式中，其他多肽包括定位序列(例如将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽)、便于纯化的标签或者用于免疫反应(例如免疫印迹)的标签。本文所述融合多肽中的光学探针和其它多肽之间可具有接头。
34、本发明另一方面还提供核酸分子，其包含：(a)本文任一实施方案所述的多肽或探针的编码序列，或(b)(a)的互补序列，或(c)(a)或(b)的片段。所述片段是引物。
35、本发明还涉及上述核酸分子的变体，包括编码本发明光学探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。
36、本发明另一方面还提供包含本文所述核酸分子的核酸构建物。该核酸序列编码本发明所述光学探针或融合多肽。
37、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。
38、在一个或多个实施方案中，所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。
39、在一些实施方案中，表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。
40、本发明另一方面还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：(1)表达本发明任一实施方案所述的光学探针或融合多肽；(2)包含本发明任一实施方案所述的核酸分子；或(3)包含本发明任一实施方案所述的核酸构建物。所述宿主细胞优选大肠杆菌。
41、本发明另一方面还提供肌醇检测试剂盒，包括本文所述光学探针或融合多肽或多核苷酸或如本文所述方法制备的光学探针。
42、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂：缓冲液、培养基、肌醇标准品。
43、本发明另一方面提供制备本文所述光学探针的方法，包括：提供表达本文所述光学探针或融合多肽的宿主细胞，在所述细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离光学探针或融合多肽。
44、在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)将编码本文所述肌醇光学探针的核酸分子纳入表达载体；2)将表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离肌醇光学探针。
45、本发明另一方面还提供检测样品中肌醇的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触，和检测光学活性多肽的变化。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位进行。所述样品例如血液。
46、本文另一方面还提供定量样品中肌醇的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触，检测光学活性多肽的光学变化，和根据光学活性多肽的光学变化定量样品中的肌醇。
47、本发明另一方面还提供筛选化合物(例如药物)的方法，包括：在含肌醇的体系中使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与候选化合物接触，检测光学活性多肽的光学变化，和根据光学活性多肽的光学变化筛选化合物。所述方法可以高通量地筛选化合物。
48、在一个或多个实施方案中，在含肌醇的体系中使本文所述宿主细胞与候选化合物接触，并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否能调节细胞对肌醇的摄取。
49、本发明另一方面还提供对所述肌醇进行细胞内和/或外定位的方法，包括：将含肌醇的体系与所述光学探针或所述宿主细胞接触，和检测光学活性多肽的光学变化。
50、在一个或多个实施方案中，所述体系是溶液体系、细胞体系、亚细胞体系。
51、本发明另一方面还提供本文所述肌醇光学探针或融合多肽或宿主细胞在检测样品中的肌醇、筛选化合物或肌醇的细胞内和/或细胞外中的应用。在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。
52、本发明另一方面还提供本文所述肌醇光学探针或融合多肽或多核苷酸或核酸构建物或宿主细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的肌醇、筛选化合物或肌醇的细胞内和/或细胞外定位。
53、本发明的有益效果：本发明提供的肌醇光学探针易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测肌醇，省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本技术所提供的肌醇光学探针对肌醇的最高响应达到对照的5倍以上，并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测，并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中肌醇定量检测。