一株适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母及其在单细胞蛋白中的应用的制作方法

本发明属于微生物发酵及食品，具体涉及一株适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母及其在单细胞蛋白中的应用。

背景技术：

1、马克斯克鲁维酵母属于酵母科克鲁维属，广泛存在于酸马奶、生奶、水果等自然环境中。马克斯克鲁维酵母是一种食品安全级别的酵母，其安全性已经获得了相关部门的安全认证，表明其在食品和饲料行业中具有巨大的潜力。随着对马克斯克鲁维酵母研究不断深入，其在食品、饲料及医药等领域中的应用与日俱增。在专利文献cn105002102b中，披露了一株保藏编号为cgmcc no.10060的马克斯克鲁维酵母菌株，该菌株制备的红茶菌蛋白饮料具有避免杂菌污染、稳定性好、口感好、功能性强等优点，适用于工业化生产。在专利文献cn115505539b中，披露了一株从天然发酵的开菲尔酸奶中筛选出的马克斯克鲁维酵母yjmk-3，该菌株对发酵乳品感官及风味化合物组成有显著影响，可应用于发酵乳品加工。在专利文献cn116831209b中，披露了一株名为cgmcc no.10621的马克斯克鲁维酵母菌株，可用于提高糟渣类饲料可消化蛋白，有益于减少饲料中豆粕的添加量。然而，马克斯克鲁维酵母发酵过程中存在周期长、低产量、成本高等问题，限制了其在实际应用中的范围。本发明旨在提供一株适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母，且能高效利用低廉底物转化为优质蛋白原料，其产物作为新型蛋白可用于肉类替代品、奶制品替代品、蛋白质补充品等领域。

技术实现思路

1、本发明从内蒙古自治区乌兰察布市收集传统发酵乳制品筛选得到适用于高密度培养高产单细胞蛋白的马克斯克鲁维酵母菌株（ kluyveromyces marxianus）ns127，由此提出本发明。

2、本发明首先提供适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母菌株，可应用于替代蛋白领域。所述菌株保藏编号为cgmcc no.30034，其保藏时间为2024年3月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），分类命名为马克斯克鲁维酵母 kluyveromyces marxianus。

3、本发明进而提供所述的马克斯克鲁维酵母菌株在制备单细胞蛋白中的应用。

4、进而提供所述的马克斯克鲁维酵母菌株的高密度发酵的方法，其是在摇瓶或发酵罐内通过多次补料的方法进行高密度培养。

5、具体地，所述高密度培养基中碳源为糖蜜，氮源为氨水、氯化铵或玉米浆粉。

6、更具体地，培养的初始培养基，除碳源、氮源外，其它组成为：kh2po41-3 g/l，mgso4·7h2o1 g/l，cacl2·2h2o75 mg/l， edta-2nac15 mg/l，znso4·7h2o4.5 mg/l，mncl2·7h2o1 mg/l，cuso4·5h2o0.3 mg/l，na2moo4·2h2o0.4 mg/l，feso4·7h2o 3 mg/l，ki 0.1 mg/l，生物素0.1 mg/l，泛酸钙1 mg/l，烟酸1 mg/l，0-1 %消泡剂，ph在4-6范围内。

7、另外具体地，采用的补料培养基配方为：糖蜜235-400 g/l，nh4cl 0-72.95 g/l，kh2po410.7-21.4 g/l，mgso4·7h2o 2.65-5.65 g/l，edta-2na 0-0.25 g/l，cacl2·2h2o0-0.85 g/l，znso4·7h2o 0-0.0425 g/l，feso4·7h2o 0-0.25 g/l，mncl2·7h2o 0-0.02g/l，cuso4·5h2o 0-0.006 g/l，na2moo4·2h2o 0-0.004 g/l，ki 0-0.001 g/l，生物素0-0.001 g /l，泛酸钙0-0.01 g/l，烟酸0-0.01 g/l。

8、在具体实施方式中，摇瓶高密度培养：摇瓶内培养6-8h后，对培养基进行3-5次补料，补料后总糖浓度为10-25 g/l，温度为28-38℃， ph 4.5-5.5，发酵时长为48-72 h；发酵罐高密度培养：温度为28-38℃，转速为400-800rpm，罐压为0.05-0.08 mpa，培养6-8h后开始补料，初始补料速度为20-30 ml/h，随着生物量增长逐步提高补料速度至40-50ml/h，发酵罐内总糖浓度维持在10-25g/l，当溶氧降低到10%时，降低补料速度至25-35ml/h，同时溶氧关联搅拌和通气量，溶氧维持在10-30%，ph4.5-5.5，发酵时长为30-48h。

9、本发明提供一种制备单细胞蛋白原料的方法，其采用所述的方法进行发酵，发酵结束后进行发酵液离心，无菌水清洗菌体，将收集到的生物质进一步冷冻干燥，得到冻干生物质或进一步通过研磨，得到粉末状生物质即作为单细胞蛋白原料。

10、优选地，所述单细胞蛋白原料中必需氨基酸占比总氨基酸含量不低于40%，总膳食纤维含量不低于 20%，总脂肪含量不低于4%，碳水化合物含量不低于20%。

11、本发明还提供所述的方法得到的单细胞蛋白原料，可应用于制备高纤维高蛋白饮料、功能食品、宠物食品的替代蛋白产品。因而，本发明提供所得到的单细胞蛋白原料在制备高纤维高蛋白饮料、功能食品、宠物食品的替代蛋白产品中的应用。

12、本发明适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母菌株具有以下特点：其来源于内蒙古乌兰察布市传统发酵乳制品，通过克鲁维酵母差异培养基（kdm培养基）分离纯化，基于无机氮源培养基筛选得到。能够高效利用糖蜜作为碳源，且能利用无机氮源，碳源转化效率0.79g生物质/g总糖，氮源转化效率达0.56 g/g；基于补料培养的方式高密度发酵30h，获得的菌体干重可达87.20 g/l，总蛋白产量高达30.01g/l，其中生物质转化效率为2.91g/l/h，蛋白转化效率为1.00 g/l/h。而专利文献cn201811381662.2中披露的酵母高密度培养每g糖最高得率为0.51g生物质，发酵时长为108 h；另一发明专利cn 105087403b中披露的酵母高密度培养中每g糖最高得率为0.54 g生物质，发酵时长为57 h。由此可见，本发明菌株在底物利用率及单位时间转化效率方面均具有显著优势，在工业生产中具有巨大的应用前景。

13、本发明制备的菌体蛋白具有完整的氨基酸谱，其中必需氨基酸占总氨基酸含量的42.89%，富含膳食纤维、不饱和脂肪、微量元素等营养成分。不仅可作为优质的替代蛋白原料，同时也是优质膳食纤维和不饱和脂肪的来源，可制备高纤维高蛋白饮料；具有较高含量的呈味物质，如谷氨酸等，可提高动物的采食量，具有制备单细胞蛋白宠物饲料的潜力。

技术特征：

1.一株适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述菌株保藏编号为cgmcc no.30034。

2.如权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌株在制备单细胞蛋白中的应用。

3.如权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌株的高密度发酵的方法，其特征在于，其是在摇瓶或发酵罐内通过多次补料的方法进行高密度培养。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高密度培养基中碳源为糖蜜，氮源为氨水、氯化铵或玉米浆粉。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，培养的初始培养基，除碳源、氮源外，其它组成为：kh2po41-3 g/l，mgso4·7h2o1 g/l，cacl2·2h2o75 mg/l， edta-2nac15 mg/l，znso4·7h2o4.5 mg/l，mncl2·7h2o1 mg/l，cuso4·5h2o0.3 mg/l，na2moo4·2h2o0.4 mg/l，feso4·7h2o 3 mg/l，ki 0.1 mg/l，生物素0.1 mg/l，泛酸钙1 mg/l，烟酸1 mg/l，0-1 %消泡剂，ph在4-6范围内。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用的补料培养基配方为：糖蜜235-400 g/l，nh4cl 0-72.95 g/l，kh2po4 10.7-21.4 g/l，mgso4·7h2o 2.65-5.65 g/l，edta-2na 0-0.25 g/l，cacl2·2h2o 0-0.85 g/l，znso4·7h2o 0-0.0425 g/l，feso4·7h2o 0-0.25 g/l，mncl2·7h2o 0-0.02 g/l，cuso4·5h2o 0-0.006 g/l，na2moo4·2h2o 0-0.004 g/l，ki0-0.001 g/l，生物素0-0.001 g /l，泛酸钙0-0.01 g/l，烟酸0-0.01 g/l。

7.如权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，摇瓶高密度培养：摇瓶内培养6-8h后，对培养基进行3-5次补料，补料后总糖浓度为10-25 g/l，温度为28-38℃， ph 4.5-5.5，发酵时长为48-72 h；发酵罐高密度培养：温度为28-38℃，转速为400-800rpm，罐压为0.05-0.08 mpa，培养6-8h后开始补料，初始补料速度为20-30ml /h，随着生物量增长逐步提高补料速度至40-50ml/h，发酵罐内总糖浓度维持在10-25g/l，当溶氧降低到10%时，降低补料速度至25-35ml/h，同时溶氧关联搅拌和通气量，溶氧维持在10-30%，ph4.5-5.5,发酵时长为30-48h。

8.一种制备单细胞蛋白原料的方法，其特征在于，采用如权利要求3至7任一项所述的方法进行发酵，发酵结束后进行发酵液离心，无菌水清洗菌体，将收集到的生物质进一步冷冻干燥，得到冻干生物质或进一步通过研磨，得到粉末状生物质即作为单细胞蛋白原料。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单细胞蛋白原料中必需氨基酸占比总氨基酸含量不低于40%，总膳食纤维含量不低于 20%，总脂肪含量不低于4%，碳水化合物含量不低于20%。

10.如权利要求8或9所述的方法得到的单细胞蛋白原料。

11.如权利要求10所述的单细胞蛋白原料在制备高纤维高蛋白饮料、功能食品、宠物食品的替代蛋白产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一株适用于高密度培养的马克斯克鲁维酵母及其在单细胞蛋白中的应用。所述菌株的保藏编号为CGMCC No.30034，从传统的发酵乳制品分离纯化而得。本发明所述菌株能够利用廉价碳源糖蜜和无机氮源，基于补料培养的方式获得高密度菌体，所述菌体干重可达87.20 g/L，总蛋白产量高达30.01g/L，是一种优质的蛋白原料，膳食纤维含量达23.7%，可用于制备高纤维高蛋白饮料、功能食品、宠物食品等高蛋白产品。本发明利用马克斯克鲁维酵母高效转化廉价底物，为低成本、绿色的单细胞蛋白生产提供技术支撑，在替代蛋白领域具有广阔的应用前景。

技术研发人员：康定荣,吴燕燕,董立超
受保护的技术使用者：苏陀科技（北京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5