本发明涉及生物，具体涉及一种质粒及其应用。
背景技术：
1、在过去的20年中，等温dna/rna扩增方法得到了快速发展。其中，滚环扩增(rolling circle amplification，rca)是最早和最广泛使用的技术之一。rca是模拟自然界微生物环状dna滚环复制过程，建立起来的一种核酸检测方法。以环状dna为模板，通过一个短的dna引物(与部分环状模板互补)，在phi29 dna聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链，最终产生重复的长单链dna产物。在rca基础上通过引入与延伸产物退火杂交的另一条或多条引物可形成超分支rca，实现超指数式扩增。rca技术具有灵敏度高，特异性好，易操作等特点，因此可应用于snp检测、质粒体外酶促生产、dna测序模板制备等场景。rca是一种简单高效的等温酶促扩增策略，反应条件温和，在复杂的生物环境中具有稳定性和高效率。此外，rca可以恒温高效地扩增dna模板，可以应用于质粒的扩增，从而避开大肠杆菌发酵系统，去除细菌质粒生产过程中的弊端，消除质粒dna插入宿主基因组的风险。
2、mrna体外转录合成是在体外的无细胞体系中，以线性化质粒dna为模板，利用rna聚合酶转录合成mrna的过程。传统的dna制造技术是使用大肠杆菌发酵制造的。这种制造质粒dna的方法在速度、安全性、可扩展性方面均存在固有的局限性。mrna疫苗最耀眼的优势就是快速的研发和生产，而奠定此基础的是mrna制备过程完全是一个化学合成反应，避开细胞发酵过程。如果生物制剂的整个工艺流程全部靠化学反应合成，那么既能保证批次的均一性，整个工艺生产也会变得简单可控。但是，当回顾mrna疫苗生产的整个工艺流程，我们会发现最上游的模板制备依然是靠生物发酵来完成的。那么我们是否可以找到一种避开生物发酵，纯粹借助高效率高产量的体外合成系统来规模化生产质粒呢？
3、rca可应用于mrna体外转录合成。然而，滚环扩增会随机停止，导致dna模板的不完整，因此转录的mrna可能并非全长。此外，dna纯度影响rna纯度，不纯的rna会影响其表达水平。在前期研究中，我们发现直接使用滚环扩增后的产物进行线性化，dna较为不纯。采用该dna作为模板进行体外转录，获得的mrna与大肠杆菌发酵获得质粒体外转录后获得的mrna在质控水平上表现相当，但当转染到细胞后，蛋白翻译水平相差巨大。目前touchlight已经成功将rca技术应用于质粒制备。doggybone dna是2010年由touchlight开发出一种新颖的体外酶法合成dna载体的方法。这套酶法合成系统用到一个非常特殊的原核端粒酶teln(源自噬菌体n15)，具有切割-连接活性，可用于合成线性闭合mini dna载体。通过该种方式，可以对不纯的rca产物进行纯化，获得完整的闭合环状质粒。但该方案已经申请了专利(参见cn102301010b)，且该方案中使用的teln价格昂贵，大大增加了成本。
技术实现思路
1、如上所述，滚环扩增会随机停止，导致dna模板的不完整。而体外转录的模板需包含启动子、5’utr、cds、3’utr和polya结构，dna模板的不完整会导致最终转录得到的mrna并非全长。此外，dna纯度影响rna纯度，不纯的rna会影响其表达水平。在前期研究中，我们发现直接使用滚环扩增后的产物进行线性化，dna较为不纯。采用该dna作为模板进行体外转录，获得的mrna与大肠杆菌发酵获得质粒体外转录后获得的mrna在质控水平上表现相当，但当转染到细胞后，蛋白翻译水平相差巨大。
2、为解决上述问题，本发明通过对dna模板进行独特的重新设计与构建，在滚环扩增结束后对dna模板进行纯化，主要通过核酸内切酶+核酸外切酶+寡核苷酸的纯化方式，使得dna纯度大大提高。作为其中一种应用，用该种方案制备的dna模板可应用于体外转录，获得的mrna转染到细胞后，翻译水平与大肠杆菌制备质粒相当，不逊于(甚至小优于)touchlight专利(参见cn102301010b)。
3、因此，本发明第一方面提供了一种质粒，其从5’-3’方向包含第一核酸内切酶的识别位点、目的基因和第二核酸内切酶的识别位点；
4、其中，所述第一核酸内切酶识别并切割所述质粒后能产生大于等于4个碱基的3’突出粘性末端，且所述第二核酸内切酶识别并切割所述质粒后能产生平末端或5’突出粘性末端。
5、在一些实施方案中，所述第二核酸内切酶为iis型核酸内切酶。
6、在一些优选的实施方案中，所述第一核酸内切酶包含psti、kpni、paei、saci和paci。
7、在一些优选的实施方案中，所述第二核酸内切酶包含包含bspqi、bsai、drai、esp3i和ecori。
8、在一些实施方案中，所述质粒还包含启动子、5’utr、信号肽、3’utr和polya尾中的一种或几种元件。
9、若所述质粒包含启动子，则所述启动子位于所述第一核酸内切酶的识别位点和所述目的基因之间。
10、若所述质粒包含polya尾，则所述polya尾位于所述目的基因和所述第二核酸内切酶的识别位点之间。
11、在一些实施方案中，所述启动子包含原核启动子和真核启动子；优选地，所述真核启动子包含cmv启动子和/或所述原核启动子包含t7启动子。
12、在一个具体的实施方案中，本发明首先在质粒模板设计上，在启动子(例如t7启动子)前引入例如psti这种能产生大于等于4个碱基的3’突出粘性末端的核酸内切酶，保证t7启动子处不受核酸外切酶(例如exoiii)的消化，保证t7启动子部分处于双链dna，以便于t7rna聚合酶的结合。与此同时，在polya后引入能产生平末端或5’突出粘性末端(包含iis型核酸内切酶作用后所产生的末端)的核酸内切酶。这种内切酶的切割位点位于识别位点之外，线性化后的dna模板上不会留下“疤痕”，能够确保polya尾长度的准确性和无额外核苷酸的添加，因此体外转录过程中也不会添加不需要的核苷酸。此外，产生5’突出粘性末端后，exoiii可以在dna的5’-3’链缺口处的3’-端释放5’-单核苷酸，产生单链dna片段。采用这种模板设计，我们可以制备出启动子不受影响，但是3’端产生粘性末端的双链dna。采用相对应的寡核苷酸(例如oligo da)磁珠/填料对该种dna进行纯化，即可获得纯度较高的dna模板。
13、在本发明中，核酸外切酶的其中一种示例为exoiii，其3’→5’脱氧核糖核酸外切酶活性对双链dna具有特异性。exoiii从平末端、5’-突出端或缺口处降解dsdna，从dna链的3’-端释放5’-单核苷酸，产生单链dna片段。其在dna 3’-突出端(至少四个碱基长，且不带有3’-末端c-残基)、单链dna或硫代磷酸酯连接的核苷酸上不具活性。
14、本发明第二方面提供了一种用于滚环扩增的dna模板的制备方法，其包括：
15、a)获得质粒，其中所述质粒从5’-3’方向包含第一核酸内切酶的识别位点、目的基因和第二核酸内切酶的识别位点；
16、b)使用滚环扩增法扩增所述质粒；
17、c)使所述第一核酸内切酶和所述第二核酸内切酶与步骤b)的产物接触，其中，所述第一核酸内切酶识别并切割所述质粒后产生大于等于4个碱基的3’突出粘性末端，且所述第二核酸内切酶识别并切割所述质粒后产生平末端或5’突出粘性末端；和
18、d)使可以从dna平末端、5’-突出端或缺口处降解dsdna，而不能从dna 3’-突出端和单链dna处降解的核酸外切酶(例如exoiii)与步骤c)的产物接触。
19、在一些实施方案中，所述方法还包含e)使用寡核苷酸(oligo nucleotide)磁珠或填料对步骤d)的产物进行纯化，所述寡核苷酸与步骤d)的产物的粘性末端互补。
20、在本发明中，所述质粒经滚环扩增后的产物，经过所述第一和第二核酸内切酶切割，所得dna产物在一端产生大于等于4个碱基的3’突出粘性末端，在另一端产生平末端或5’突出粘性末端。经过所述核酸外切酶消化后，所得dna产物在5’端消化出更长的粘性末端，根据该粘性末端，可设计与其特异性互补结合的寡核苷酸，该寡核苷酸偶联至磁珠或者填料可对dna产物进一步纯化。
21、在一些实施方案中，所述第二核酸内切酶为iis型核酸内切酶。
22、在一些优选的实施方案中，所述第一核酸内切酶包含psti、kpni、paei、saci和paci。
23、在一些优选的实施方案中，所述第二核酸内切酶包含bspqi、bsai、drai、esp3i和ecori。
24、在一些实施方案中，所述exoiii的量相对于所述质粒的量是饱和的。
25、在一些优选的实施方案中，所述质粒和所述exoiii的比例为每pmole所述质粒加入150单位所述exoiii。
26、在一些实施方案中，所述步骤a)中的所述质粒还包含启动子、5’utr、信号肽、3’utr和polya尾中的一种或几种元件。
27、在一些优选的实施方案中，所述步骤a)中的所述质粒还包含位于所述目的基因和所述第二核酸内切酶的识别位点之间的polya尾，且其中所述方法还包括步骤e)使用寡核苷酸(oligo nucleotide)磁珠或填料对步骤d)的产物进行纯化，所述寡核苷酸与polya尾互补。
28、在一些优选的实施方案中，所述步骤a)中的所述质粒还包含位于所述第一核酸内切酶的识别位点和所述目的基因之间的启动子，且所述启动子包含原核启动子和真核启动子；优选地，所述真核启动子包含cmv启动子和/或所述原核启动子包含t7启动子。
29、本发明第三方面提供了一种通过体外转录制备mrna的方法，其包括：
30、a)获得质粒，其中所述质粒从5’-3’方向包含第一核酸内切酶的识别位点、启动子、目的基因、polya尾和第二核酸内切酶的识别位点；
31、b)使用滚环扩增法扩增所述质粒；
32、c)使所述第一核酸内切酶和所述第二核酸内切酶与步骤b)的产物接触其中，所述第一核酸内切酶识别并切割所述质粒后产生大于等于4个碱基的3’突出粘性末端，且所述第二核酸内切酶识别并切割所述质粒后产生平末端或5’突出粘性末端；
33、d)使可以从dna平末端、5'-突出端或缺口处降解dsdna，而不能从dna 3'-突出端和单链dna处降解的核酸外切酶(例如exoiii)与步骤c)的产物接触与步骤c)的产物接触；
34、e)使用寡核苷酸(oligo nucleotide)磁珠或填料对步骤d)的产物进行纯化；和
35、f)以步骤e)的产物为模板通过体外转录获得mrna。
36、在一些实施方案中，所述第二核酸内切酶为iis型核酸内切酶。
37、在一些优选的实施方案中，所述第一核酸内切酶包含psti、kpni、paei、saci和paci。
38、在一些优选的实施方案中，所述第二核酸内切酶包含bspqi、bsai、drai、esp3i和ecori。
39、在一些实施方案中，所述exoiii的量相对于所述质粒的量是饱和的。
40、在一些优选的实施方案中，所述质粒和所述exoiii的比例为每pmole所述质粒加入150单位所述exoiii。
41、在一些实施方案中，所述启动子包含原核启动子和真核启动子；优选地，所述真核启动子包含cmv启动子和/或所述原核启动子包含t7启动子。
42、本发明通过对dna模板进行独特的重新设计与构建，在滚环扩增结束后对dna模板进行纯化，主要通过内切酶+外切酶+寡核苷酸的纯化方式，使得dna纯度大大提高。用该种方案制备的dna模板应用于体外转录，获得的mrna转染到细胞后，翻译水平与大肠杆菌制备质粒相当。
43、本发明第四方面提供了上述质粒在制备体外转录模板或真核表达dna中的应用。
44、本发明第五方面提供了上述质粒在通过体外转录制备mrna或真核表达dna中的应用。
45、通过上述方案，我们研发了基于核酸外切酶和寡核苷酸纯化的滚环扩增dna作为模板应用于体外转录，而且未使用到teln，建立了简单、高产、经济、快速、可放大的dna模板制备工艺。基于该方案，可以将前期dna模板的制备缩短至以天为单位(不同于大肠杆菌的以月为单位的菌种建库，工艺开发与制备流程)；反应体系可从大型发酵罐缩小至ep管或离心管中；且恒温反应无需精确的温度控制，可以很大程度上降低研发及生产成本，降低生物药的上市成本，减轻研究单位、企业及使用者的经济负担，有利于更多项目的推进以及针对更多潜在疗法的研究。