本发明涉及生物技术和医药化学领域，具体涉及腺苷酸琥珀酸裂解酶purb在调控阿卡地新生物合成中的应用。
背景技术：
1、阿卡地新(acadesine,aicar)具有广泛的生物活性，目前正在进行第三次临床试验，显示了其作为新型药物开发的潜力。本发明旨在分析aicar生物合成途径中的关键步骤，为aicar的工程化生产奠定理论基础。本课题组前期研究发现，全局调控因子vea编码基因的过表达显著提高了茄病镰刀菌中aicar的产量和增强了该菌株的抗肿瘤活性。通过转录组与代谢组的联合分析，确定了aicar的合成途径主要由10步反应组成，腺苷酸琥珀酸裂解酶(purb)在aicar的代谢过程中作为限速酶，发挥着至关重要的作用。进一步研究发现，当腺苷酸琥珀酸裂解酶基因的表达量得到提升时，内生茄病镰刀菌的aicar含量显著增加。有趣的是，在fsveaoe14中，purb的表达量显著下调，这与vea过表达时aicar产量增加相矛盾，暗示除purb外的其他基因可能参与aicar的合成。因此，对内生茄病镰刀菌中purb同工酶的分析发现了两个与purb结构域相似的蛋白pro06469和pro10879，这两个蛋白编码基因在fsveaoe14中显著上调表达。据此推测，vea很可能通过某种机制对腺苷酸琥珀酸裂解酶系统的平衡状态起到关键的调控作用，参与了内生茄病镰刀菌中aicar的合成。综上所述，全局性调控因子vea在茄病镰刀菌中发挥着关键作用，它通过调控腺苷酸琥珀酸裂解酶来介导aicar的合成过程，进而影响了内生茄病镰刀菌的抗肿瘤活性。本发明致力于揭示菌株hb1-j1 aicar的代谢调控机制，为aicar的高效生物合成提供理论依据。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术的不足，提出了腺苷酸琥珀酸裂解酶purb在调控阿卡地新生物合成中的应用。
2、具体是通过以下技术方案来实现的：
3、腺苷酸琥珀酸裂解酶purb在调控阿卡地新生物合成中的应用。
4、具体，上述应用是指通过在茄病镰刀菌hb1-j1中过表达腺苷酸琥珀酸裂解酶purb上调茄病镰刀菌hb1-j1中阿卡地新含量。
5、所述应用包括如下步骤：1)构建如权利要求1所述腺苷酸琥珀酸裂解酶purb的过表达载体；2)采用根癌农杆菌电击转化的方法将purb的过表达载体导入的茄病镰刀菌hb1-j1中，使purb基因在茄病镰刀菌中表达量升高。
6、进一步地，所述应用包括如下步骤：
7、1)构建腺苷酸琥珀酸裂解酶purb的过表达载体：根据purb基因的测序结果设计引物，然后以hb1-j1的总dna为模板，利用pcr技术扩增purb基因，再将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过切胶回收获得纯化的目的基因片段，然后利用snabi限制性内切酶对含有pk2-hyg的质粒进行线性化处理，获得线性化的载体，最后将线性化的载体与purb基因片段通过连接酶进行连接，即得purb的过表达载体；
8、2)采用根癌农杆菌电击转化的方法将purb的过表达载体导入的茄病镰刀菌hb1-j1中，使purb基因在茄病镰刀菌中表达量升高：将purb的过表达载体加入根癌农杆菌agl-1感受态细胞中，并混合均匀，然后将混合物放入电击转化仪中，电压设置为2.2-2.4kv/min，电压时间为6ms，进行电击转化，电击转化完成后，立即将混合物转移至含有卡那霉素和羧苄青霉素抗生素的液体培养基中，在28℃、180rpm条件下培养至根癌农杆菌复苏；随后，将培养好的根癌农杆菌agl-1与茄病镰刀菌hb1-j1进行共培养，筛选出成功导入purb的过表达载体的茄病镰刀菌。
9、所述purb基因扩增的上游引物为atcctcgagtacgtaatgtccgacgatcaccag，下游引物为ctttctagatacgtattagacattcagctgcgc。
10、1、本发明首次揭示了全局调控因子vea在茄病镰刀菌中调控aicar生物合成途径的机制，其中腺苷酸琥珀酸裂解酶(purb)作为限速酶在aicar合成中发挥关键作用。
11、2、本发明发现了vea可能通过调控腺苷酸琥珀酸裂解酶系统的平衡状态来影响菌株hb1-j1的aicar的生物合成，同时发现两个与purb结构域相似的蛋白pro06469和pro10879在aicar合成中可能发挥重要作用。
12、3、本发明提供了一种提高aicar产量的生产方法，包括过表达全局调控因子vea基因或腺苷酸琥珀酸裂解酶(purb)基因，从而提高茄病镰刀菌中aicar的产量。
13、有益效果：
14、(1)高效性、准确性：通过过表达purb基因，显著地、精准地提高了aicar的产量，本发明方法可用于高效生产aicar。
15、(2)可推广性：本发明的方法不仅适用于茄病镰刀菌hb1-j1，还可以应用于其他具有类似代谢途径的微生物中，为其他代谢产物的生产提供借鉴和参考。
16、(3)应用价值高：aicar作为一种重要的生物活性物质，在医药、农业等领域具有广泛的应用前景。而本发明方法为大量提供aicar物质奠定了物质基础并给予了技术支持。
1.腺苷酸琥珀酸裂解酶purb在调控阿卡地新生物合成中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在茄病镰刀菌hb1-j1中过表达腺苷酸琥珀酸裂解酶purb，上调茄病镰刀菌hb1-j1中阿卡地新含量。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：1)构建如权利要求1所述腺苷酸琥珀酸裂解酶purb的过表达载体；2)采用根癌农杆菌电击转化的方法将purb的过表达载体导入的茄病镰刀菌hb1-j1中，使purb基因在茄病镰刀菌中表达量升高。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述purb基因扩增的上游引物为atcctcgagtacgtaatgtccgacgatcaccag，下游引物为ctttctagatacgtattagacattcagctgcgc。