一种工程化嗜盐菌及用其生产3-羟基丁酸的方法与流程

本发明涉及微生物，尤其涉及一种工程化嗜盐菌及用其生产3-羟基丁酸的方法。

背景技术：

1、3-羟基丁酸 (3-hydroxybutyrate，3hb)也称为β-羟基丁酸 (β-hydroxybutyrate)，是一种酮体。3hb是人类酮体的组成部分之一，常常作为饥饿或运动时的能量来源。除此之外，3hb也被认为是一种治疗剂，实验证明口服3hb药物对癫痫、高血压、nlrp3介导的炎症或神经退行性疾病等多种疾病均有治疗作用。在小鼠中施用3hb后，还观察到促进骨形成、改善学习和记忆以及保护神经胶质细胞。在动物模型中，3hb已被证明可以改善葡聚糖硫酸钠 (dextran sulfate sodium，dss)诱导的结肠炎。而ecn通常用于治疗炎症性肠病 (inflammatory bowel disease，ibd)，因此将治疗性化合物3hb和益生菌ecn联合使用会显示出协同作用，治疗性化合物3hb的原位合成还可以减少药物的脱靶效应，并在更长的时间内有效地输送3hb，从而显著提高结肠炎的治疗效果。

2、现有技术中，cn 117736958 a公开了一种产（r）-3-羟基丁酸的大肠杆菌及其构建方法和应用，其通过在大肠杆菌中敲除6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因 edd和6-磷酸果激酶i基因 pfka，并过表达下述基因：乙酰乙酰辅酶a硫代内酯酶基因 phaa、(r) -3-羟基丁酸coa脱氢酶基因 phab、硫酯酶基因 tesb以及双功能磷酸酮醇酶基因 xfpk和二磷酸酶基因 fbp得到能够产（r）-3-羟基丁酸的重组大肠杆菌。但是，该工程化改造手段复杂，仅适用实验室摇瓶发酵，难以工业化推广应用。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术存在的问题，本发明利用嗜盐菌通过工程化改造获得了一种能够高效合成3-羟基丁酸的工程化嗜盐菌。

2、基于此，提出如下技术方案。

3、首先，本发明提供了一种工程化嗜盐菌，所述工程化嗜盐菌不表达聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac且过表达硫酯酶基因 tesb。

4、嗜盐菌是一类能在高盐环境中生长的微生物，具有独特的适应机制和生物学功能，广泛被应用于发酵生产中，嗜盐菌内源可天然合成聚3-羟基丁酸（poly[(r)-3-hydroxybutyrate]，p3hb），但是无法合成3-羟基丁酸小分子。

5、本发明通过让聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac不表达同时让硫酯酶基因 tesb过表达，从而让嗜盐菌高效合成3-羟基丁酸小分子，工程化改造路线示意图如图1所示。

6、优选地，所述工程化嗜盐菌为工程化盐单胞菌。

7、盐单胞菌是分离自新疆维吾尔自治区艾丁盐湖的一类中度嗜盐菌，其作为嗜盐菌中广泛应用的一类细菌，经过工程化改造后具有广阔的工业化应用前景。

8、优选地，所述盐单胞菌为 halomonas bluephagenesis td1.0、 halomonas  campaniensis ls21、 halomonas bluephagenesis wzy254、 halomonas bluephagenesis td68-194或 halomonas bluephagenesis tdh4。

9、优选地，所述聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac的核苷酸序列为seq id no.1所示；所述硫酯酶基因 tesb的核苷酸序列为seq id no.2所示。

10、在具体实施过程中，让所述工程化嗜盐菌不表达聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac的手段包括但不限于：敲除聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac、沉默聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac的表达、干扰聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac的表达、阻断聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac的转录或翻译、让聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac失活、让聚3-羟基丁酸酯合成酶基因 phac突变（例如对所述基因进行一个或多个核苷酸的插入、缺失或替换）等。

11、在具体实施过程中，所述过表达的手段包括但不限于：

12、（1）导入含有硫酯酶基因 tesb的质粒；

13、（2）增加硫酯酶基因 tesb的拷贝数；

14、（3）改变硫酯酶基因 tesb的启动子序列；

15、（4）将强启动子与硫酯酶基因 tesb可操作地连接；

16、（5）导入增强子。

17、优选地，过表达硫酯酶基因 tesb采用诱导型表达系统或组成型表达系统。

18、优选地，所述诱导型表达系统中采用的启动子为mmp1（seq id no.3）。

19、当采用诱导型表达系统时，诱导剂（例如iptg）的用量为0.5~500mg/l，优选为1~200mg/l，较优选为10~200mg/l，更优选为80~120mg/l，最优选为90~110mg/l。

20、优选地，所述组成型表达系统中采用的启动子为pporin221（seq id no.4）、pporin68（seq id no.5）、pporin42（seq id no.6）或pporin58（seq id no.7）；优选为pporin58。

21、本发明进一步发现，选择不同的启动子过表达硫酯酶基因 tesb时，3-羟基丁酸的合成水平存在显著差异，当采用pporin58启动子时，可大幅提升工程化嗜盐菌合成3-羟基丁酸的能力。

22、进一步，本发明提供了所述工程化嗜盐菌在3-羟基丁酸生产或选育3-羟基丁酸生产菌中的应用。

23、以上所述生产菌的选育可采用基因工程改造、诱变、适应性进化等方法。

24、进一步，本发明提供了一种3-羟基丁酸的生产方法，包括：发酵培养所述的工程化嗜盐菌。

25、优选地，所述发酵培养采用的培养基以mm培养基为基础培养基，添加终浓度为10-30g/l的葡萄糖以及30-60g/l的氯化钠，ph为8.5~9.5。

26、优选地，所述发酵培养的温度为35℃-39℃，最优选为37℃。

27、优选地，所述发酵培养结束后，收集培养物中的3-羟基丁酸，并将菌体离心重悬后加入丙酮酸，进一步收集重悬液中的3-羟基丁酸。

28、本发明进一步发现，通过利用丙酮酸进行全细胞催化，优化3-羟基丁酸的提取工艺，能够进一步提升3-羟基丁酸的产量。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：

30、本发明利用嗜盐菌通过工程化改造获得了一种能够高效合成3-羟基丁酸的工程化嗜盐菌，实现了3-羟基丁酸在嗜盐菌中从零到一合成的突破。本发明的提出为3-羟基丁酸的工业化生产提供了优良菌种，而且本发明的生产工艺简单，成本低廉，给予工业化发酵生产3-羟基丁酸提供了更多的选择，具有广阔的应用前景。