组织分离、保存用缓冲液及其应用、培养肿瘤类器官的方法与流程

文档序号:40165501发布日期:2024-11-29 15:58阅读:64来源:国知局
组织分离、保存用缓冲液及其应用、培养肿瘤类器官的方法与流程

本发明涉及类器官培养领域,具体涉及组织分离、保存用缓冲液及其应用、培养肿瘤类器官的方法。


背景技术:

1、液体来源的肿瘤组织样本运输在生物实验中极为重要,便捷、高效的离体储存和运输方式是其中必不可少的一环。常见的液体肿瘤样本包括恶性的积液样本和外周血液样本。恶性积液是一种在恶性肿瘤患者身体内积聚的生理液体,通常是由于恶性肿瘤细胞在体内生长和扩散时,侵入周围的组织和器官并破坏正常的组织结构,导致体液(浆液)的过度积聚。这些恶性细胞可以通过血液循环或淋巴系统进一步传播,从而在肿瘤患者的腔隙或器官中积聚。恶性积液主要包括恶性胸膜腔积液、恶性腹腔积液、恶性心包积液和恶性脑积液,是癌症的常见病理生理现象,其液体中通常含有恶性肿瘤细胞、蛋白质、细胞碎片、白细胞、红细胞、细胞外液和多种生物活性分子,其产生和积聚与肿瘤的发展和进展密切相关,对于癌症的诊断和治疗至关重要。循环肿瘤细胞(ctcs)是从原发性肿瘤或转移性肿瘤脱落并进入血液循环中的肿瘤细胞。ctcs在血液中的存在是肿瘤细胞获得侵袭性和转移性的标志。这些细胞在血液循环中通过多种机制逃避免疫系统的监视,并最终定植于远端组织形成转移瘤。ctcs的存在和数量与肿瘤的转移和复发密切相关,因此,ctcs的检测和监测成为了评估癌症进展和治疗效果的重要手段。

2、肿瘤类器官是一种生物学模型,主要是利用患者的肿瘤组织进行体外的三维培养,来模拟体内肿瘤组织的生物学特性。肿瘤类器官可以在体外模拟肿瘤细胞生长的微环境,对于研究肿瘤的发生、发展、药物反应有着重大的意义。

3、目前,能够用于液体来源肿瘤组织样本分离和长时间运输的保护液报道少,从中分离肿瘤干细胞并构建得到的肿瘤类器官的数量少,成功率低。因此,研究适于液体来源肿瘤组织样本分离和运输保护用溶液,对于确保肿瘤干细胞活性、提高肿瘤类器官构建成功率和得率意义重大。


技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提供了组织分离和/或保存用缓冲液及其应用。本发明的缓冲液用于液体来源肿瘤组织样本的运输保护,肿瘤细胞活性保持率高,利用其构建肿瘤类器官,成功率高、数量多,能满足临床检测需求和疾病研究需求。

2、在本发明的第一方面,本发明提出了一种缓冲液。根据本发明的实施例,所述缓冲液用于保存肿瘤组织样本,所述肿瘤组织样本为液体来源的;所述缓冲液包括:基础培养基和特异性添加因子,所述特异性添加因子包括:超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、青霉素、链霉素。

3、根据本发明的实施例,以所述基础培养基的体积计,所述超氧化物歧化酶的浓度为1~100 μg/ml,所述过氧化氢酶的浓度为50~500 μg/ml,所述青霉素的浓度为50~200u/ml,所述链霉素的浓度为50~200 μg/ml。

4、示例性地,所述超氧化物歧化酶的浓度可以为1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml、100 μg/ml。

5、示例性地,所述过氧化氢酶的浓度可以为50 μg /ml、100 μg /ml、150 μg /ml、200 μg /ml、250 μg /ml、300 μg /ml、350 μg /ml、400 μg /ml、450 μg /ml、500 μg /ml。

6、示例性地,所述青霉素的浓度可以为50 u/ml、75 u/ml、100 u/ml、125 u/ml、150u/ml、175 u/ml、200 u/ml。

7、示例性地,所述链霉素的浓度可以为50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml、125 μg/ml、150 μg/ml、175 μg/ml、200 μg/ml。

8、根据本发明实施例的缓冲液用于液体来源肿瘤组织样本的分离、运输保护,肿瘤细胞活性保持率高,利用其构建肿瘤类器官,成功率高、数量多,能满足临床检测需求和疾病研究需求。

9、根据本发明的实施例,以所述基础培养基的体积计,所述超氧化物歧化酶的浓度为20 μg/ml,所述过氧化氢酶的浓度为300 μg/ml,所述青霉素的浓度为100 u/ml,所述链霉素的浓度为100 μg/ml。由此,进一步维持肿瘤细胞在运输和保存过程中的高活性。

10、根据本发明的实施例,所述特异性添加因子还包括:维生素e;以所述基础培养基的体积计,所述维生素e的浓度为1.25~100 nm。发明人经过大量试验发现,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和维生素e三种组分能协同增效,进一步提高肿瘤细胞活性的保持率。

11、示例性地,所述维生素e的浓度可以为1.25 nm、2.5 nm、5 nm、10 nm、20 nm、30nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm。根据本发明的实施例,所述特异性添加因子还包括:转铁蛋白、重组人白蛋白或人血白蛋白、y27632、庆大霉素、两性霉素。

12、根据本发明的实施例,以所述基础培养基的体积计,所述转铁蛋白的浓度为1~100 nm,所述重组人白蛋白或人血白蛋白的浓度为0.025~10 mg/ml,所述y27632的浓度为0.5~50 μm,所述庆大霉素的浓度为1~100 μg/ml,所述两性霉素的浓度为10~1000 ng/ml。

13、示例性地,所述转铁蛋白的浓度可以为1 nm、5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90nm、95nm、100 nm。

14、示例性地,所述重组人白蛋白或人血白蛋白的浓度可以为0.025 mg/ml、0.05mg/ml、0.1 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml。

15、示例性地,所述y27632的浓度可以为0.5 μm、1 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30μm、35 μm、40 μm、45μm、50 μm。

16、示例性地,所述庆大霉素的浓度可以为1 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml、100 μg/ml。

17、示例性地,所述两性霉素的浓度可以为10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000ng/ml。

18、根据本发明实施例的缓冲液,能为液体来源的肿瘤组织样本提供全面的保护和支持,以提高细胞存活率和维持细胞功能。

19、根据本发明的实施例,以所述基础培养基的体积计,所述维生素e的浓度为25 nm,所述转铁蛋白的浓度为20 nm,所述重组人白蛋白或人血白蛋白的浓度为0.5 mg/ml,所述y27632的浓度为10 μm,所述庆大霉素的浓度为10 μg/ml,所述两性霉素的浓度为250 ng/ml。由此,进一步维持肿瘤细胞在运输和保存过程中的高存活率及高活性。

20、根据本发明的实施例,所述特异性添加因子还包括:n-乙酰半胱氨酸酰胺;以所述基础培养基的体积计,所述n-乙酰半胱氨酸酰胺的浓度为0.0625~10 mm。由此进一步维持肿瘤细胞的存活和功能,减少细胞死亡。

21、示例性地,所述n-乙酰半胱氨酸酰胺的浓度可以为0.0625 mm、0.13 mm、0.25 mm、0.5 mm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10mm。

22、根据本发明的实施例,所述n-乙酰半胱氨酸酰胺的浓度为1.25 mm。

23、根据本发明的实施例,所述缓冲液还包括5~50 mm的氢离子缓冲剂。由此,根据本发明实施例的缓冲液,能为液体来源的肿瘤组织样本提供更加稳定的环境。

24、示例性地,所述氢离子缓冲剂的浓度可以为5 mm、10 mm、20 mm、30 mm、40 mm、50mm。

25、根据本发明的实施例,所述氢离子缓冲剂为hepes,浓度为10 mm。由此,根据本发明实施例的缓冲液能进一步减少肿瘤细胞在保存和运输过程中的应激反应,降低细胞损伤,延长保存时间。

26、根据本发明的实施例,所述基础培养基为dmem/f12。发明人研究发现,基础培养基dmem/f12与上述特异性添加因子能协同作用,为多种肿瘤细胞提供营养适宜的环境。由此,根据本发明实施例的缓冲液能适用于多种肿瘤细胞,有助于保持其细胞活力和功能。

27、根据本发明的实施例,所述肿瘤组织样本来自恶性积液、外周血、骨髓抽取物、肺泡灌洗液、尿液、胸腔或腹腔穿刺抽液中的至少之一。

28、根据本发明的实施例,所述恶性积液包括恶性胸腔积液、恶性腹腔积液、恶性心包积液、恶性脑积液中的至少之一。

29、在本文中,术语“恶性胸腔积液”为肺癌、乳腺癌或其他癌症转移至胸膜而产生的胸腔内积液。术语“恶性腹腔积液”等同于“腹水”,常见于卵巢癌、胃癌、肝癌等引起的腹腔内积液。术语“恶性心包积液”为肺癌、乳腺癌等特定癌症转移至心包时产生的心包腔内积液。术语“恶性脑积液”为脑肿瘤或转移至脑膜的癌症导致脑积液中出现肿瘤细胞。肿瘤细胞(循环肿瘤细胞,circulating tumor cells,ctcs细胞)从原发肿瘤或转移肿瘤脱落后进入血液循环,由此外周血中可能含有肿瘤细胞。在某些情况下,比如白血病或特定类型淋巴瘤患者的骨髓液可能含有肿瘤细胞。在肺癌或其他肺部疾病中,通过支气管镜进行肺泡灌洗所获得的液体样本,可能含有肿瘤细胞。在某些泌尿系统肿瘤(如膀胱癌)中,尿液中可能含有肿瘤细胞。肿瘤患者的胸腔或腹腔穿刺抽液也可能含有肿瘤细胞。

30、在本发明的第二方面,本发明提出了前述的缓冲液在肿瘤组织样本保存中的应用,所述肿瘤组织样本为液体来源的。

31、本领域技术人员能够理解的是,前面针对缓冲液所描述的特征和优点,同样适用于该应用,在此不再赘述。

32、根据本发明的实施例,所述肿瘤组织样本来自恶性积液、外周血、骨髓抽取物、肺泡灌洗液、尿液、胸腔或腹腔穿刺抽液中的至少之一。

33、根据本发明的实施例,所述恶性积液包括恶性胸腔积液、恶性腹腔积液、恶性心包积液、恶性脑积液中的至少之一。

34、根据本发明的实施例,所述肿瘤组织样本用于肿瘤类器官培养。

35、根据本发明的实施例,所述肿瘤类器官包括:肺腺癌类器官、肺癌类器官、乳腺癌类器官、结直肠癌类器官、卵巢癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、脑肿瘤类器官、膀胱癌类器官、脑膜癌类器官中的至少之一。

36、在本发明的第三方面,本发明提出了一种培养肿瘤类器官的方法。根据本发明的实施例,包括:将肿瘤组织样本进行类器官培养处理前,保存在如前述的缓冲液中,所述肿瘤组织样本为液体来源的。根据本发明实施例的方法,成功率高、数量多,试验重复性好。

37、本领域技术人员能够理解的是,前面针对缓冲液所描述的特征和优点,同样适用于该方法,在此不再赘述。

38、根据本发明的实施例,所述肿瘤组织样本来自恶性积液、外周血、骨髓抽取物、肺泡灌洗液、尿液、胸腔或腹腔穿刺抽液中的至少之一。

39、根据本发明的实施例,所述恶性积液包括胸腔积液、腹腔积液、心包积液、脑积液中的至少之一。

40、根据本发明的实施例,所述肿瘤类器官包括:肺腺癌类器官、肺癌类器官、乳腺癌类器官、结直肠癌类器官、卵巢癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、脑肿瘤类器官、膀胱癌类器官、脑膜癌类器官中的至少之一。

41、与现有技术相比,本发明的有益效果:

42、1、本发明的组织分离和/或保存用缓冲液适用于短期存储或运输原代液体来源肿瘤组织样本以及组织分离,可有效避免样本在分离、储存或运输过程中的细胞凋亡、坏死等现象,维持肿瘤细胞,尤其是肿瘤干细胞的生物功能和活力。

43、2、本发明的组织分离和/或保存用缓冲液能在4℃条件下,维持液体来源肿瘤组织样本内大部分细胞的活力长达48h以上,显著减少从样本分离到实验开始过程中的活性损耗,有效提高利用各类原代液体肿瘤组织构建培养肿瘤类器官的成功率和器官数量。

44、3、本发明的组织分离和/或保存用缓冲液还能用于肿瘤组织样本后续处理过程中的重悬清洗。

45、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。

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